Валиева Г.А.
МЕТОДЫ ИНДУКЦИИ СУПЕРОВУЛЯЦИИ С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ ОПТИМАЛЬНОГО КОЛИЧЕСТВА ЭМБРИОНОВ, ПРИГОДНЫХ К ТРАНСПЛАНТАЦИИ *
Аннотация:
были проведены исследования по разработке и усовершенствованию высокоэффективной технологии трансплантации эмбрионов чуйской популяции овец. Изучены влияния гонадотропных гормонов фоллигон (Folligon) и плюсет (Pluset) на суперовуляторную эффективность применения на матках едильбаевской породы овец
Ключевые слова:
овцы, фоллигон, плюсет, эмбрионы, суперовуляция
УДК 63.636; 612.64;591.3
Валиева Г.А.
магистр технических наук
Казахский национальный аграрный исследовательский университет
(г. Алматы, Казахстан)
МЕТОДЫ ИНДУКЦИИ СУПЕРОВУЛЯЦИИ С ЦЕЛЬЮ
ПОЛУЧЕНИЯ ОПТИМАЛЬНОГО КОЛИЧЕСТВА
ЭМБРИОНОВ, ПРИГОДНЫХ К ТРАНСПЛАНТАЦИИ
Аннотация: были проведены исследования по разработке и усовершенствованию высокоэффективной технологии трансплантации эмбрионов чуйской популяции овец. Изучены влияния гонадотропных гормонов фоллигон (Folligon) и плюсет (Pluset) на суперовуляторную эффективность применения на матках едильбаевской породы овец.
Ключевые слова: овцы, фоллигон, плюсет, эмбрионы, суперовуляция.
В настоящее время технология ускоренного воспроизводства с применением технологии трансплантации эмбрионов включена в долгосрочные племенные программы многих развитых стран мира по разведению, улучшению и сохранению существующих животных. Это, в свою очередь, в значительной степени зависит от разработки наиболее оптимальных и экономически выгодных решений, как в технологической цепи трансплантации эмбрионов, так и при освоении и внедрении новых биотехнологических методов получения эмбрионов и сохранения их вне организма.
Большое количество половых клеток в яичниках самок и возможность более полного использования генетического потенциала особо ценных в племенном отношении маток является базовой основой метода трансплантации эмбрионов. Эффективное использование генетически ценной самки-донора с использованием метода трансплантации эмбрионов предполагает получение от неё в одну индуцированную охоту множества оплодотворенных яйцеклеток и пересадку их менее ценным животным для получения как можно большего количества потомства. Это позволяет значительно ускорить процессы воспроизводства генетически ценных животных.
Для гормональной стимуляции множественной овуляции применяют с разной степенью эффективности отдельно или в их сочетании гонадотропные препараты гипофизарного и сывороточного происхождения, гестагены короткого и длительного действия, а также препараты с лютеолитическим эффектом.
В литературе имеется факт наличия зависимости от дозы FSHp. Использование сверх высоких доз FSHp вызывает уменьшение продукции эмбрионов, и оказывает депрессивное действие на овец, обработанных предварительно аналогом GnRH. [1]. Поскольку, предварительной обработкой подавляется эндогенный ЛГ пик овуляция индуцируется интравенной инъекцией 3 мг свиного LH (Reprobiol-Liege, University, Belgium) через 32 часа после извлечения вагинальных губок у предварительно обработанных овец [2].
Следует подчеркнуть, что к настоящему времени разработано множество протоколов индукции суперовуляции в яичниках коров с использованием гонадотропинов в сочетании с простагландинами, в соответствующих методических рекомендациях приводится большое количество схем применения гормональных препаратов используемых в этих целях [3]. Все эти методы, в общем, позволяют вызвать множественную овуляцию в яичниках у определенного процента коров. Одним из существенных недостатков имеющихся приемов индукции суперовуляции является высокая вариабельность количества получаемых от обработанных животных эмбрионов [4,5]. Поэтому особую актуальность для решения этой проблемы приобретают вопросы выравнивания по разным биологическим характеристикам коров-доноров эмбрионов и подбор оптимального сочетания индукторов и режимов их введения для увеличения результативности суперовуляции у коров и получения относительно лучше прогнозируемого количества эмбрионов, пригодных для эмбриотрансплантаций [6, 7].
Можно ожидать, что эффективность индукции суперовуляции во многом зависит от работы гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы и напрямую связана с исходной активностью процессов, происходящих в этой нейроэндокринной оси конкретного организма [8]. Разнообразие реакции яичников связывается с различиями в индуцировании суперовуляции, таких как подготовка доноров, партия и общая доза основного индуктора, использование дополнительных гормонов, а также индивидуальные особенности животных. Все эти факторы могут лежать в основе вариабельности ответа на суперовуляцию при использовании известных схем ее индукции. Известные индукторы и протоколы их введения, созданные для усиления фолликулярной волны, всё же не способны исключить вариативность реакции на суперовуляцию [9].
Материалы и методы
Синхронизация эстральных циклов доноров и реципиентов
Путь интенсификации процесса воспроизводства является биотехнологический метод синхронизации полового цикла. Основной идеей данного биотехнологического приема является возможность управлять процессами воспроизводства, целенаправленно воздействуя и изменяя проявление тех или иных репродуктивных процессов. В данном случае речь идет о практической возможности регулировать прихождение маток в охоту.
При применении метода синхронизации достигается сразу несколько целей. Во-первых, нет необходимости ждать спонтанного прихода животных в охоту. Во-вторых, метод синхронизации позволяет регулировать количество ежедневно приходящих в охоту животных, что также делает искусственное осеменение прогнозируемым. После синхронизации половая охота проявляется одновременно в течение 36–48 час. после обработки у 90–100% животных. Это позволяет планировать начало кампании осеменения, а также регулировать количество маток в охоте. В-третьих, при хорошо организованной синхронизации нет необходимости держать на маточной отаре пробников и проводить ежедневную трудоёмкую выборку маток в охоте. При этом очень важно, что весь приплод будет гарантированно получен от назначенных в случку производителей. В-четвёртых, значительно сокращаются сроки искусственного осеменения и соответственно ягнения и козления. В зависимости от возможностей и желания сельхозпроизводителя, а также условий хозяйствования осеменение отары (600–650 маток) проводится за 8–10 дней (в место обычных 35–40). При этом ягнение/козление продолжается 15–20 дней (вместо 40–60). При применении метода синхронизации увеличение затрат на обработку животных компенсируется значительным снижением трудозатрат, повышением технологичности проведения осеменения и ягнения/козления, отсутствием затрат на содержание пробников. В результате прямые затраты на проведение кампании осеменения снижаются в среднем на 50–60%. Для обеспечения круглогодичного цикла воспроизводства применяют метод индукции половой охоты в анэстральный период. Для синхронизации половых (эстральных) циклов у овец-доноров и у овец-реципиентов применяли препарат эстрофан (Чехия), данный препарат является аналогом простагландина F2α. При применении данного препарата прерывается лютеолитическая фаза полового цикла, т.е. его применение вызывает лизис желтого тела яичника и соответственно прекращение синтеза и выброса прогестерона, гормона беременности. В эксперименте для синхронизации половых циклов у доноров и реципиентов применяли внутримышечную инъекцию эстрофана в дозе 250 мкг для каждого животного. В течение 5 дней проверяли животных на наличие эструса с использованием баранов-пробников.
В ходе исследований по синхронизации половых циклов у доноров и реципиентов с применением эстрофана в дозе 250 мкг было выявлено, что из 36 голов (18 доноров и 18 реципиентов) синхронизация циклов была достигнута у 20 животных, что составляет 65,3%. Таким образом, применение препарата эстрофана в дозе 250 мкг уровень синхронизации половых циклов у овец-доноров и у овец-реципиентов достигает 65,3%.
Индукция суперовуляции у овец шуйской популяции в анэстральные и эстральные сезоны
Для стимуляции суперовуляции были использованы различные типы гормональных препаратов: гонадотропин гипофизарный - Плюсет (Pluset) (Laboratorios Calier S.A., Barcelona) и гонадотропин сывороточный - Фоллигон (Folligon) (Intervet International B.V., Нидерланды); плацентарный хорулон - (Chorulon) (Intervet International B.V., The Netherlands); простагландин - Эструмэйт (Estrumate) (Vet Pharma Friesoythe GmbH, Germany).
Для индукции суперовуляции у овец Фоллигон вводили в дозах 1000 - 1200 МЕ, согласно приведённой схеме (табл 1).
Таблица 1 - Схема применения препарата Фоллигон.
|
День полового цикла |
Препарат |
Доза и способ введения |
|
11 |
Фоллигон |
1000-1200 М.Е., в/м |
|
12 |
- |
- |
|
13 |
Эструмейт |
125-250 мкг, в/м |
|
14-15 |
Хорулон (hCG) |
300-500 МЕ, в/в |
|
|
Охота, осеменение |
|
Через 48 ч после начала обработки Фоллигоном вводили Эструмейт -препарат простагландина F2 альфа. Для стимуляции овуляции и повышения оплодотворяемости применяли Хорулон (Chorulon) однократно внутримышечно (в/м) или внутривенно (в/в) в дозе 300-500 М.Е., в день охоты перед осеменением за 3-5 часов.
Выявление овец - доноров эмбрионов в охоте проводили 2 раза в день. По мере прихода животных в охоту их случали с баранами-производителями соответствующей породы дважды в день до окончания охоты.
Активность действующего вещества в 1 мл раствора - 50 МЕ фолликулостимулирующего гормона и 50 МЕ лютеинизирующего гормона. Препарат вводили на 8 – 11 дни полового цикла, внутримышечно 2 раза в сутки, с интервалом в 12 часов, в понижающихся дозах, общая доза составляла 250-300 И.Е. (табл. 2).
Таблица 2 - Схема применения препарата Плюсет
|
День введения препа-рата |
Часы введе-ния |
Препарат |
Доза |
Актив-ность дозы |
Способ введения |
|
День 1 |
07:00 ч |
Плюсет
|
1,0 мл |
50 М.Е. |
в/м |
|
19:00 ч |
1,0 мл |
50 ЕД |
- |
||
|
День 2 |
07:00 ч |
Плюсет
|
0,5 мл |
25 ЕД |
- |
|
19:00 ч |
0,5 мл |
25 ЕД |
- |
||
|
День 3 |
07:00 ч |
Плюсет
|
0,5 мл |
25 ЕД |
|
|
19:00 ч |
0,5 мл |
25 ЕД |
- |
||
|
День 4 |
07:00 ч |
Плюсет Эструмейт |
0,5мл 0,5мл |
25 ЕД 125 мкг |
- |
|
19:00 ч |
Плюсет |
0,5 мл |
25 ЕД |
- |
|
|
День 5 |
07:00 ч 19:00 ч |
Хорулон |
1,0 |
300 М.Е. |
в/в
|
|
Охота, осеменение |
|||||
Через 60 часов после начала обработки Плюсетом вводили препарат простагландина F2λ. Эструс регистрируется через 36-40 часов после введения простагландинов. Хорулон (Chorulon) применяли в дозе 300-500 М.Е. однократно в/м или в/в, в день охоты перед осеменением за 3-5 ч.
Выявление овец - доноров эмбрионов в охоте проводили 2 раза в день. По мере прихода животных в охоту их случали с баранами-производителями соответствующей породы дважды в день до окончания охоты.
Морфологическая оценка эмбрионов
Полученные эмбрионы сразу же после обнаружения под микроскопом (стереоскопический микроскоп МБС-9) оценивали по морфологическим признакам, под фазово-контрастным микроскопом Axiostar Plus (Zeiss, Germany) при 60-80 -кратном увеличении.
Характеристика состояния эмбрионов необходима для выявления среди них способных, к развитию и пригодных для пересадки реципиенту. При оценке учитывали стадию развития эмбриона, соответствие ее хронологическому возрасту, определяли морфологическое состояние эмбриона и, исходя из этих критериев, устанавливали его качество и пригодность для дальнейшего использования. Морфологическую оценку качества эмбрионов проводили под стереомикроскопом с увеличением в 60-80 раз. Стадии развития эмбриона согласно международной классификации (International Embryo Transfer Society, IETS).
Результаты и обсуждение
Индукция суперовуляции у овец чуйской популяции в анэстральные и эстральные сезоны
Проведены работы по выборке овец в естественной охоте для подбора групп доноров эмбрионов по принципу аналогов. Установлена продолжительность половых циклов у экспериментальных животных.
Десять овец были разделены на 2 группы. Овец I группы (n=5) стимулировали по схеме 1 (Фоллигон 1000-1400 МЕ). Через 48 ч вводили Эструмейт в дозе 250 мкг. Овец II группы (n=5) стимулировали по схеме 2 (Плюсет 250-300 И.Е.). Плюсет вводили в уменьшающихся дозах, два раза в день, начиная с 8-10 дня цикла. Препарат простагландина F2α в дозе 125 мкг вводили через 60 часов после начала обработки Плюсетом. Всем маткам вводили Хорулон (300-500 М.Е.) через 8 ч после начала эструса.
После начала течки овцы естественно случались с баранами дважды в день до конца течки. Спустя 3 дня после спаривания, была сделана паховая лапаротомия, и зарегистрировано число жёлтых тел. Эмбрионы были получены хирургически путем при промывании каждого рога матки. Результаты гормональной стимуляции овцематок приведены в таблице 3 (табл. 3).
Таблица 3 - Суперовуляторная реакция яичников в зависимости от типа гормонального препарата
|
Показатель |
Тип препарата |
|
|
Фоллигон |
Плюсет |
|
|
Обработано овец |
5 |
5 |
|
Из них с полиовуляцией: n (%) |
3(60) |
5 (100) |
|
Число овуляций на донора: среднего |
7,9±4,2 |
8,2 ± 0,10 |
|
положительного |
7,2 ± 4,5 |
8,0 ± 0,10 |
|
Выход эмбрионов, % |
68,5 |
72,6 |
|
Число полноценных эмбрионов |
6,5 ± 0,9 |
6,9 ± 0,7 |
Из 5 овец, которым вводили Фоллигон, у 3 животных средний уровень овуляции на положительного донора составил 7,2 ± 4,5 выход эмбрионов в среднем составил 68,5%, а количество полноценных эмбрионов 6,5±0,9 на донора. Все животные (5 голов) обработанные Плюсетом, обнаружили суперовуляторную реакцию, (8,2±0,10 на одного донора) соответственно. Выход эмбрионов и количество полноценных эмбрионов составили 72,6% и 6,9±0,7 соответственно. Статистические различия в овуляциях, выходе эмбрионов и степени оплодотворения между группами, были незначительны.
Трансплантация эмбрионов реципиентам
После морфологической оценки эмбрионов, проводили трансплантацию эмбрионов реципиентам хирургическим методом. Получены следующие результаты: первичная приживляемость составила 50,0% (табл. 4).
Таблица 4 - Изучение приживляемости при применении хирургического метода трансплантации эмбрионов
|
Показатель |
Хирургический метод |
|
Общее количество трансплантированных эмбрионов, n |
10 |
|
Общее количество реципиентов, n |
10 |
|
Общее количество суягных реципиентов, n (%) (первичная приживляемость) |
8 |
|
Общее количество рожденных ягнят, n (%) |
5 (50%) |
Выводы
Таким образом можно заключить, что в период сезона размножения показана эффективность применения гормональных препаратов фоллигон и плюсет для гормональной стимуляции суперовуляции и полученяи полноценных эмбрионов у овец чуйской популяции.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
Номер журнала Вестник науки №6 (63) том 3
Ссылка для цитирования:
Валиева Г.А. МЕТОДЫ ИНДУКЦИИ СУПЕРОВУЛЯЦИИ С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ ОПТИМАЛЬНОГО КОЛИЧЕСТВА ЭМБРИОНОВ, ПРИГОДНЫХ К ТРАНСПЛАНТАЦИИ // Вестник науки №6 (63) том 3. С. 1101 - 1110. 2023 г. ISSN 2712-8849 // Электронный ресурс: https://www.вестник-науки.рф/article/9124 (дата обращения: 17.05.2024 г.)
Вестник науки СМИ ЭЛ № ФС 77 - 84401 © 2023. 16+