Апросимов Д.А., Дьяконова А.Т., Куркина И.И.
ИЗУЧЕНИЕ МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА *
Аннотация:
в работе получены однослойные первичные культуры клеток дермальных фибробластов крупного рогатого скота, проведена их морфометрическая характеристика. Результаты работы и полученные данные имеют значение для дальнейших исследований в области клеточной биологии, фармакологии, а также смежных дисциплин
Ключевые слова:
первичные клеточные культуры. фибробласты, морфометрическая характеристика клеток
УДК 57.085.23
Апросимов Д.А.
лаборант-исследователь
Отдел ботанических исследований
Института биологических проблем криолитозоны
ЯНЦ СО РАН
(г. Якутск, Россия)
Дьяконова А.Т.
младший научный сотрудник
НИИ прикладной экологии Севера
Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова
(г. Якутск, Россия)
Куркина И.И.
кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник
Учебно-научно технологическая лаборатория "Графеновые нанотехнологии"
Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова
(г. Якутск, Россия)
ИЗУЧЕНИЕ МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ
ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ
КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Аннотация: в работе получены однослойные первичные культуры клеток дермальных фибробластов крупного рогатого скота, проведена их морфометрическая характеристика. Результаты работы и полученные данные имеют значение для дальнейших исследований в области клеточной биологии, фармакологии, а также смежных дисциплин.
Ключевые слова: первичные клеточные культуры. фибробласты, морфометрическая характеристика клеток.
Культуры клеток используются в клеточной и молекулярной биологии в качестве модельных систем для изучения нормальной физиологии и биохимии клеток, воздействия лекарств и токсичных соединений на клетки, а также мутагенеза и канцерогенеза. Также они используются при скрининге и разработке лекарственных препаратов и крупномасштабном производстве биологических соединений (например, вакцин, терапевтических белков). Наибольшее распространение для изучения получили фибробласты. Изучением морфофункциональных свойств и оценкой жизнеспособности культур дермальных фибробластов сельскохозяйственных животных в отечественной науке занялись сравнительно недавно. До недавнего времени большая часть исследований в области генетических технологий для использования в сельском хозяйстве была сосредоточена на секвенировании геномов, обнаружении и каталогизации вариантов последовательностей для различных видов и пород. Дальнейший прогресс в области генетического совершенствования видов и пород сельскохозяйственных животных связывают с развитием технологий геномного редактирования (GE). Именно применение GE-технологий в рутинном режиме, в будущем станет определяющим фактором в обеспечении конкурентоспособности производства сельскохозяйственной продукции. Создание собственных линий животных с заданными свойствами непосредственно связано с культивированием различных клеточных культур. Первым и самым важным этапом вышеуказанного длительного и сложного исследования является поиск оптимальных условий для получения и культивирования клеток млекопитающих различных видов и характеристика полученных культур.
Целью данного исследования является получение однослойных первичных культур клеток дермальных фибробластов крупного рогатого скота и их морфометрическая характеристика.
Материалы и методы. Работа была выполнена в лаборатории “Молекулярная палеонтология” НИИ прикладной экологии Севера и лаборатории "Графеновые нанотехнологии" Северо-Восточного федерального университета им. М.К. Аммосова. В качестве модели были выбраны смешанные породы крупного рогатого скота из центральных районов Якутии. Культивирование и изучение морфометрических показателей фибробластов, полученных от крупного рогатого скота, проводили по стандартной методике. Для получения стабильных культур, свободных от грибковой и бактериальной контаминации, нами была модифицирована методика культивирования дермальных фибробластов крупного рогатого скота. Морфометрический анализ проводился с электронных фотографий в приложении ImageJ. Изучение морфометрических показателей (длина, ширина, площадь, плотность на культуральной чашке) аутологичных дермальных фибробластов проводили в течение трёх пассажей на временных отрезках культивирования 24, 48, 96 часов, на микроскопе Leica DFC-295 (Германия). С каждой культуры выполняли по 5 снимков в формате TIF размером 2048x1536 пикселей в случайно выбранных полях зрения при увеличении x5, x10 и х20 с помощью микроскопа Leica DFC-295 (Германия).
Морфометрические показатели определяли в программе с открытым исходным кодом для анализа и обработки изображений ImageJ (National Institutes of Health, США).
Также было проведено изучение клеток на сканирующем электронном микроскопе фирмы JSM-7800F (JEOL, Япония).
В ходе экспериментальной части исследования были получены культуры дермальных фибробластов сельскохозяйственных животных. Микроскопия культуральных чашек показала, что культуры преимущественно состоят из отростчатых, веретенообразных или распластанных клеток размером около 20-40 мкм (Рис.1). В них хорошо развиты органеллы внутренней метаболической среды. Ядро фибробласта овальной формы, характеризуются преобладанием клеток узкой вытянутой формы, с хорошо визуализируемым ядром и ядрышками, с 2 – 4 отростками. Цитоплазма отчетливо подразделяется на интенсивно окрашенную эндоплазму и слабо окрашенную эктоплазму. Цитоплазма фибробластов базофильна. В ней выявляется хорошо развитая эндоплазматическая сеть с большим количеством рибосом, прикрепленных к мембранам в виде цепочек более 10 гранул.
В клетках в различных временных отрезках (24ч, 48ч и 96ч) при визуальном сравнении наблюдается значимые визуальные различия в плотности, а также количеству отростков.
Рис. 1. Фибробласты через 96 часов культивирования на увеличении х20.
Подсчет клеток проводился в конечном цикле пассажа, непосредственно перед новым пассированием. При разделении клеток на две культуральные чашки наблюдается лаг фаза клетки в течении первых 24 часов после пересева (пассирования) (Рис.2). Между 2м и 3м пассажом зафиксированы отрицательные показатели лаг фазы (Табл. 5).
Рис. 2. График роста клеток (шт.).
Таблица 5. Количество клеток (шт./1мл)
|
Пассаж |
Количество в начале (шт./1мл) |
Количество в конце (шт./1мл) |
|
Пассаж – 1 |
1х103 |
2,5х103 |
|
Пассаж – 2 |
1,25х103 |
3х103 |
|
Пассаж – 3 |
1,25х103 |
3х103 |
Рис. 3. Открепленный фибробласт на сканирующем
электронном микроскопе. Увеличение х5000.
На сканирующем электронном микроскопе выявлен средний диаметр открепившегося фибробласта (Рис.3). Фиксация препарата трипсинизированного фибробласта проводилась в трёх растворах – раствор DMEM, физиологический раствор и вода для инъекций. На препарате, зафиксированном в физиологическом растворе кристаллизация была минимальна. Средний диаметр неприкрепившегося фибробласта равен около 10-12 мкм.
В настоящей работе были получены культуры дермальных фибробластов крупного рогатого скота характеризующиеся преимущественно двумя видами клеток: незрелые фибробласты – это клетки веретеновидной формы с 1 – 3 отростками, и зрелые активно функционирующие фибробласты веретеновидной формы с 3 и более отростками. Число клеток в монослое составило около 5660 шт. в каждой культуральной чаше диаметром 60 мм. Монослой образуется в среднем за 10 дней культивирования. Показатель жизнеспособности клеток 98%. В ходе проведенных морфометрических исследований было установлено, что клетки уплощены, распластаны по дну культуральной чашки. Прирост в пассажах по длине составил ~ 1,5 мкм, по ширине ~ 0,05 мкм, по площади ~ 4,5мкм2. Рост показателей по ходу пассирования минимален, что показывает устойчивое состояние морфометрических показателей монослоя.
Список литературы:
Номер журнала Вестник науки №6 (63) том 2
Ссылка для цитирования:
Апросимов Д.А., Дьяконова А.Т., Куркина И.И. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА // Вестник науки №6 (63) том 2. С. 911 - 917. 2023 г. ISSN 2712-8849 // Электронный ресурс: https://www.вестник-науки.рф/article/8908 (дата обращения: 17.05.2024 г.)
Вестник науки СМИ ЭЛ № ФС 77 - 84401 © 2023. 16+