Авакимян А.О.
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И ИХ МОДИФИКАЦИИ ДЛЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ КРУПНОКОСТОЧКОВЫХ КУЛЬТУР (ПЕРСИК, АБРИКОС,СЛИВА) *
Аннотация:
в работе рассмотрены различные аспекты питательных сред для микроклоновального размножения крупнокосточковых культур. Описаны традиционные составы питательных сред, используемые в современной практике, а также их недостатки и ограничения. Затем представлены новые подходы и модификации питательных сред, разработанные с целью повышения выживаемости и роста микроклонов крупнокосточковых культур. В частности, описаны важные компоненты питательных сред, такие как минеральные элементы, органические добавки и регуляторы роста, а также оптимальные соотношения между ними. Представлены перспективы и потенциальные проблемы в применении модифицированных питательных сред в практике размножения крупнокосточковых культур. Проведённый анализ исследований позволяет сделать выводы о перспективности использования модифицированных питательных сред для улучшения эффективности микроклоновального размножения персика, абрикоса и сливы. Это исследование способствует развитию современных методов размножения крупнокосточковых культур и имеет практическую значимость для садоводов и селекционеров
Ключевые слова:
микроклоновальное размножение, крупнокосточковые культуры, минеральные элементы, регуляторы роста, pH, фотосинтетический свет, садоводство, селекция
УДК 631
Авакимян А.О.
аспирант, 3 курс
Северо-Кавказский федеральный
научный центр садоводства, виноградарства, виноделия
(г. Краснодар, Россия)
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И ИХ МОДИФИКАЦИИ
ДЛЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ
КРУПНОКОСТОЧКОВЫХ КУЛЬТУР (ПЕРСИК, АБРИКОС, СЛИВА)
Аннотация: в работе рассмотрены различные аспекты питательных сред для микроклоновального размножения крупнокосточковых культур. Описаны традиционные составы питательных сред, используемые в современной практике, а также их недостатки и ограничения. Затем представлены новые подходы и модификации питательных сред, разработанные с целью повышения выживаемости и роста микроклонов крупнокосточковых культур. В частности, описаны важные компоненты питательных сред, такие как минеральные элементы, органические добавки и регуляторы роста, а также оптимальные соотношения между ними. Представлены перспективы и потенциальные проблемы в применении модифицированных питательных сред в практике размножения крупнокосточковых культур. Проведённый анализ исследований позволяет сделать выводы о перспективности использования модифицированных питательных сред для улучшения эффективности микроклоновального размножения персика, абрикоса и сливы. Это исследование способствует развитию современных методов размножения крупнокосточковых культур и имеет практическую значимость для садоводов и селекционеров.
Ключевые слова: микроклоновальное размножение, крупнокосточковые культуры, минеральные элементы, регуляторы роста, pH, фотосинтетический свет, садоводство, селекция.
ВВЕДЕНИЕ
Микроклональное размножение – это быстрое получение растений неполовым путем, идентичных исходному растению, с использованием методов in vitro. По сути, микроразмножение похоже на вегетативную форму размножения растений, с той лишь разницей, что оно осуществляется в условиях in vitro и что из изолированных клеток ткани в конечном итоге можно получить достаточное количество растений. Стерильные условия и добавление соответствующих питательных веществ позволяют при необходимости уменьшить размер проростков до нескольких миллиметров.
Число видов растений, которые можно клонировать «in vitro», в настоящее время приближается к 1000. Методы микроразмножения трудоемки и дороги, но в некоторых случаях разрабатываются экономически эффективные методы.
Этот метод имеет много преимуществ по сравнению с существующими традиционными методами размножения:
Наибольший опыт получения методами in vitro подвоев накоплен в Италии, причем большая часть из них – подвои персиковых деревьев, получаемые в производственных объемах. Перенос регенерантов в почву составляет 40-80% стоимости всего производства, однако предприятия получают 51 достаточный доход и осуществляют финансирование серьезных исследований по повышению эффективности пересадки микроклонов в почву, а также размножения привитых сортов плодовых деревьев. Кроме промышленного размножения плодовых культур in vitro, этот метод также применяется в программах по селекции при быстром размножении новых перспективных линий для полевых испытаний.
1 Особенности и этапы микроклонального размножения персика, абрикоса, сливы.
Современные промышленные технологии возделывания косточковых культур предусматривают использование только клоновых подвоев и преимущественно – слаборослых.
Важнейшим показателем пригодности клоновых подвоев для использования в интенсивных технологиях является их совместимость с сортами — привоями. По совместимости подвоев с различными косточковыми культурами выделяют две группы: 1-я – слива, абрикос, персик, миндаль и 2-я – вишня и черешня. В пределах этих групп выделяются клоновые подвои, совместимые со всеми сортами.
В настоящее время большое значение имеют несколько методов микроклонального размножения растений in vitro (в частности, для селекции растений), включая пазушное и адвентивное почкование, непрямой морфогенез и соматический эмбриогенез [1, 3, 4, 5].
Использование этих методов делают возможными:
Процесс микроклонального размножения имеет несколько этапов. Основными из них являются [5, 11, 12].
Важным шагом в микроразмножении in vitro является инкубация безвирусных материнских растений в изоляционных боксах в теплицах или зимних оранжереях в условиях, не допускающих проникновения вирусной среды. Затем растения-доноры, срезанные для культуры in vitro, должны быть проверены на наличие вирусной, микоплазменной или бактериальной инфекции с помощью методов диагностики ПЦР, молекулярной гибридизации или иммуноферментного анализа (ELISA).
Важным шагом в ИКСИ in vitro является выращивание безвирусного расплода в изоляционных боксах в теплице или зимней оранжерее, в условиях, в которые не могут попасть вирусные среды. Донорские эксплантаты для культуры in vitro должны быть проверены на наличие вирусных, микоплазменных и бактериальных инфекций с использованием методов диагностики ПЦР, молекулярной гибридизации или иммуноферментного анализа (ELISA) [6,7].
Методы ИФА позволяют быстро обнаружить большинство вирусов, заражающих косточковые плодовые культуры (вирус карликовой кольцевой гнили, вирус акульей кольцевой гнили и вирус скручивания листьев вишни); клоны, подтвержденные методом ИФА как свободные от контактной вирусной инфекции, могут быть проверены серологически и комбинированные тесты на маркерных растениях. Растения, в которых в результате тестов не обнаружены вирусы или другие регулируемые патогены, включаются в основную категорию «безвирусных» клонов. Если инфекция подтвердится, местные растения могут быть подвергнуты лечению для улучшения их здоровья. Комбинация термотерапии с воздушной сушкой и культурой in vitro является наиболее подходящей для лечения зараженных вирусом саженцев. Если вирус, тестируемый с помощью культуры тканей изолированных апикальных меристем, не является свободным, используется химиотерапия - введение в питательную среду химических веществ, подавляющих развитие вирусной инфекции у растений in vitro.
Для активного выявления бактериальной флоры иногда используют среды, обогащенные различными органическими добавками, например, гидролизатом казеина, которые вызывают рост гнилостных микроорганизмов; через 7-10 дней степень заражения оценивают визуально. Очищенные саженцы инокулируются в питательные среды для дальнейшей инкубации. На этом этапе также используется среда без регуляторов роста.
При микроклональном размножении проростков в качестве источников прорастания обычно используются верхушечные и боковые почки, а также меристематические верхушечные почки. Изоляция апикальных меристематических тканей должна проводиться в соответствии со стандартным методом после постепенной стерилизации проростков.
Среды Розенберга, Лепуавра и В5 используются для сливы, Гамборга – для персика. Однако наиболее подходящей средой для микроразмножения абрикоса и сливы является питательная среда Мурасиге-Скуга (МС).
В зависимости от стадии микроразмножения нуклеофитных растений в питательную среду добавляют 6-бензиламинопурин (6-БАП) в концентрации 0,2-2 мг/л. Для стадии инокуляции in vitro используется более низкая концентрация цитокинина – 0,2 мг/л БАП. Чтобы вызвать пролиферацию пазушных почек и максимизировать количество почек, культивирование микроорганизмов вишни и сливы проводится при концентрации 0,5-2 мг/л и 0,5-1 мг/л БАП.
Особое внимание следует уделить стадии укоренения. Процесс укоренения побегов косточковых плодовых растений in vitro зависит от характеристик сорта, количества скрещиваний, концентрации и типа адъюванта и метода применения. Для достижения полноценного микроразвития семечковых растений из среды был удален 6-БАП, который ингибирует процесс образования корневых бактерий, и в среду были введены адъюванты, в основном β-индолил-3-бутировая кислота (ИМК). Результаты показали, что оптимальная концентрация ИМК в питательной среде находилась в диапазоне 0,5-1 мг/л. Когда ИМК присутствовал в среде в концентрации 2 мг/л, образовывались оплодотворенные редиски.
Комбинация риваба (1 мл/л) и обычных фитогормонов ауксинов (ИМК и β-индолилуксусной кислоты (ИУК) по 0,5 мг/л) в среде для укоренения была показана для увеличения скорости укоренения побегов некоторых горшечных растений.
Корневые индукторы: в сравнительном испытании ИМК, ИУК и альфа-нафтилуксусной кислоты (НУК) высокая эффективность ИУК была достигнута при концентрации 6,0 мг/л. Наибольшее количество корневых черенков вишни было получено на среде, содержащей НУК. Однако в области базальной почки наблюдалась сильная пролиферация каллуса, что затрудняет пересадку укорененных ангиоспермов в нестерильных условиях.
Для эффективного укоренения саженцев очень важен не только тип стимулятора, но и способ его применения. Помимо внесения ауксина в питательную среду, побеги предварительно инокулируют в стерильном растворе ИМК (25-30) мг/л и подвергают воздействию в течение 12-24 часов. Для индукции образования корней обработка микротрансплантатов раствором ИМК оказалась экспериментально более эффективной, чем включение этого регулятора роста в культуральную среду. оказалась более эффективной, чем включение этого регулятора роста в культуральную среду. оказалась более эффективной, чем включение этого регулятора в культуральную среду. Появление первой случайной корневой массы при предварительной ризобиальной обработке наблюдалось на 20-25 день. Другим методом индуцирования образования ризобактерий является обработка побегов нуклеофитных растений порошками ИМК, содержащими тальковые ауксины (концентрации 0,125%, 0,25%) и ИУК (концентрации 0,25%, 0,5%). Использование гормональных порошков оказалось более эффективным при применении производных корневищ и более простым в производстве. Однако использование талька ИМК и различных концентраций адъювантов показало различную специфичность в укоренении микрорастений сливы [5, 8, 9].
Процесс укоренения был более активным на модифицированных субстратах МС и Уайта. По другим данным, лучшими средами для укоренения являются среда Геллера, содержащая макроэлементы и витамины, и среда МС с содержанием сахарозы, сниженным до 15 мг/л и разбавленным в 2 раза, чтобы исключить мезо-инозитол, который способствует образованию каллусной ткани. Однако в большинстве исследований для укоренения нуклеофитных микроводорослей использовалась Мурасиге и Скуга.
Таблица 1. Прописи основных питательных сред, используемых при микроклональном размножении растений.
|
Компонент |
Состав питательных сред, мг/л |
||||
|
Knudson С |
Murashige & Skoog |
Harvais I A |
Van Waes & Deberg |
||
|
BM 1 |
BM 2 |
||||
|
Ca(NO3)2 *4H2О |
1000 |
|
400 |
|
|
|
(NH 4 )2SO4 |
500 |
|
|
|
|
|
KN03 |
|
1900 |
200 |
|
|
|
CaCl2 *2H 2 О |
|
440 |
|
|
|
|
NH4NO3 |
|
1650 |
400 |
|
|
|
КH2РО4 |
250 |
170 |
200 |
240 |
240 |
|
KCI |
|
|
100 |
|
|
|
MgS04*7H2 О |
250 |
370 |
200 |
100 |
100 |
|
FeSO4 *7H 2 0 |
25 |
27,95 |
|
27,95 |
27,95 |
|
Na 2 ЭДТА |
|
37,23 |
|
37,23 |
37,23 |
|
Хелат железа |
|
|
5 мл |
|
|
|
CoCl2 *6 H 2 О |
|
0,025 |
0,02 |
|
|
|
ZnSO4 *7Н2О |
|
8,6 |
0,5 |
10 |
10 |
|
H3ВО3 |
|
6,2 |
0,5 |
10 |
to |
|
MgS04 *4H2 0 |
7,5 |
22,3 |
0,5 |
25 |
25 |
|
CuS04 *5Н2О |
|
0,025 |
0,5 |
0,025 |
0,025 |
|
Na2 МoО4*2Н2О |
|
0,25 |
0,04 |
0,25 |
0,25 |
|
KJ |
|
0,83 |
0,1 |
|
|
|
Глицин |
|
2 |
|
2 |
2 |
|
Мезоинозит |
|
100 |
|
1200 |
1200 |
|
Никотиновая кислота |
|
0,5 |
5 |
5 |
5 |
|
Тиамин |
|
0,1 |
5 |
0,5 |
0,5 |
|
Пиридоксин |
|
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
Фолиевая кислота |
|
|
|
0,5 |
0,5 |
|
Биотин |
|
|
|
0,05 |
0,05 |
|
Гидролизат казеина |
|
|
|
500 |
500 |
|
L -глютамин |
|
|
|
100 |
100 |
|
6-БАП |
|
|
|
|
0,2 |
|
Сахароза |
20000 |
30000 |
|
20000 |
20000 |
|
Картофельный экстракт |
|
|
100 мл |
|
|
|
Агар - агар |
17500 |
10000 |
10000 |
6000 |
6000 |
|
pH среды |
4 , 8 - 5 , 2 |
5 , 7 |
6 , 0 - 6 , 4 |
5 , 8 |
5 , 8 |
Преимущества и недостатки микроразмножения отражены в различных теоретических работах на эту тему. В.А. Высоцкий (2001) к преимуществам относит:
К недостаткам можно отнести:
Кроме того, микроклональное размножение часто приводит к получению плохо подготовленного материала для нестерильной культуры и требует дополнительных затрат для получения стандартных урожаев растений.
2 Подбор оптимальной среды для микроразмножения сортов сливы in vitro.
Правильно подобранная питательная среда является одним из определяющих факторов эффективности микроразмножения растений. При введении в культуру нового вида, сорта и даже тканей одного и того же вида, требуются питательные среды, различающиеся по составу.
Установлено, что наибольший коэффициент размножения после двух пассажей был на среде Мурасиге-Скуга. В зависимости от сорта коэффициент составлял от 1:3,6 до 1:5,8 единиц, на среде Гамборга от 1:2,9 до 1:3,9, самый низкий коэффициент отмечен на среде Уайта от 1:2,0 до 1:2,5.
Количество листьев на растениях в вариантах со средой Мурасиге-Скуга и средой Гамборга были практически на одном уровне и составляли 6,7 и 6,9 шт. соответственно. На среде Уайта этот показатель был ниже и составлял 4,9 шт. на одно микрорастение.
Длина микропобегов, образованных на среде Мурасиге-Скуга, также была самой высокой – 17,9 мм, на среде Гамборга – 13,9 мм, на среде Уайта – 8,2 мм. 100 Наибольшее количество хлоротичных растений отмечено на среде Уайта – 13,3 %, на среде Гамборга – 8 % и 4,7 % на среде Мурасиге-Скуга
Витрификация (стекловидность) побегов – одна из проблем, с которой приходиться сталкиваться при микроразножении растений.
По мнению О.В. Матушкиной и др. (2008, 2012) самой вероятной причиной витрификации является реакция на гормональный состав среды.
При микроразмножении сливы витрификация побегов отмечалась во всех вариантах опыта, но наименьший процент витрифицированных растений был на среде Мурасиге-Скуга – 2 %, на среде Гамборга – 6,7 %, на среде Уайта – 4,7 %.
Установлено, что для сорта Стенлей лучше всего подходит вариант со средой Мурасиге-Скуга. Коэффициент размножения на данной среде у сорта Стенлей составлял 1:5,8, длина микропобегов 19,8 мм, количество листьев – 7 шт. на растение, хотя в варианте на среде Гамборга количество листьев было почти таким же -7,1 шт. В этом варианте низкий уровень витрификации – 2 % и хлороза - 4 %.
Коэффициент размножения на среде Мурасиге-Скуга был самый высокий и составил 1:3,6, на среде Гамборга этот коэффициент был ниже 1:2,9, но по количеству листьев и длине микропобегов показатели в этих вариантах были близкими, 7,3-7,4 листовые пластинки на растении и длина побегов варьировала в пределах 15,3-15,5 мм.
Таким образом, можно сделать вывод, что лучшей средой для мультипликации in vitro сортов Стенлей, Кабардинская ранняя и Блюфри является среда Мурасиге – Скуга с добавлением БАП – 1,0 мг/л.
В последние годы все большее значение в решении вопроса о защите персиковых от вирусных болезней приобретают методы культивирования изолированных органов и тканей растений в сочетании с хемотерапией. Эти исследования проводились в основном на корнях растений. Имеется также ряд сообщений о культуре эмбрионов персика [2]. Однако методы in vitro улучшения сортов персика все еще недостаточно разработаны.
Для избавления растений от вирусов были протестированы несколько вируцидных агентов, которые добавляли в синтетические среды: рибавирин 1-15 мг/л и HEO-DHT (Германия) (2, 4-диоксогексагидро-1, 3, 5-триазин) 50-150 мг/л в среде Гамборга (B5) были основой для приготовления питательных сред. Улучшенные среды PE и PM содержали 0,5-1 мг/л BAP (Sigma, США), 0,05-0,1 мг/л βIMC (Sigma, США), 30 мг/л сахарозы и 10 мг/л агара (Испания).
В этом эксперименте первичные экспланты (активно растущие верхушки побегов и вегетативные почки), выделенные из инфицированных растений персика, вносили после добавления вирусного агента в улучшенную синтетическую питательную среду. Эксперименты с саженцами персика, зараженными вирусом некротической кольцевой гнили, показали хорошие результаты при концентрации HEO-DHT 85 мг/л. Оптимальная концентрация рибавирина, при которой микробы росли нормально и без вирусной инфекции, составляла 5 мг/л. Увеличение концентрации рибавирина значительно снизило рост микробов, обводненность и смертность. Чтобы устранить крайнее доминирование и вызвать образование нескольких побегов, был протестирован регулятор роста БАП в концентрации 0,5-1,0 мг/л.
Под действием БАП рост придаточных почек и рост побегов у персика были разными. В обоих случаях коэффициент размножения увеличивался и достигал максимального значения на 4-м проходе.
4 Введение в культуру in vitro абрикоса
При введении в культуру in vitro абрикоса Prunus armeniaca L. показала, что инфекция в основном сосредоточена в опавших листьях и ниже чешуи почек. Лучшими побегами были побеги после эндогенного покоя и развившиеся из них микробласты в специфических растворах. Наиболее активное прорастание побегов после эндогенного покоя происходило в растворах следующего состава: 5 мг/л IPA (2-изопентениладенин), 4 мг/л HA (гибберелловая кислота), 10 мг/л AgNO3. Побеги, регенерированные с помощью этого состава, легко стерилизуются и имеют низкое содержание внутренних загрязнений. Меристемы, выделенные из растущих побегов, продолжали расти только в присутствии кондиционирующего агента - пептида глутатиона. Питательная среда «M2Ab» была разработана специально для роста меристем абрикоса (Таблица 1). Эта среда поддерживает до 80% жизнеспособных проросших меристем размером 0,1-0,3 мм. Меристемы образуют гетерогенный каллус с зонами морфогенеза. Морфогенетический каллус имеет ярко-зеленый или зеленоватый цвет. Морфогенетический каллус с микробластами переносят на среду (SCC1M) через 3-4 недели, чтобы инициировать образование множественных морфогенетических полос и придаточных почек. Для нормализации роста или перед фазой укоренения микробласты переносят на среду M2ABM.
Чередование сред CCK1M и M2ABM обеспечило хорошие темпы роста (3-7 побегов на делянку) и нормальный рост побегов с темно-зелеными листьями до 40 мм без высыхания или чрезмерного полива.
Регенерация микробластов из листовых черенков была достигнута путем индукции морфогенетических каллусов. Каллус с морфогенетическими полосами и эмбрионоподобными структурами индуцировали в темноте из протравленных листьев стебля, выращенных in vitro. Каждый лист протравливали три или четыре раза в боковом направлении, не удаляя черенки полностью. Листья выращивали в осевом направлении в контакте со средой.
Среда для инициации морфогенеза "E26" из листовых черенков содержала возрастающие концентрации сахарозы (3%), 1 мг/л тидиазурона и 0,3 мг/л NUC. После переноса морфогенетических структур на среду "SCC1M" и переноса культуры на свет, морфогенетическая зона становилась зеленой и формировала эмбриоидные структуры вместе с микробластами. Затем придаточные почки, микробласты и эмбриоидные структуры переносили на среду «M2ABM» для роста микробластов или на среду «CCK1M» для дальнейшего размножения. Попытки регенерировать растения непосредственно из эмбриоидных структур не предпринимались.
Было проведено экспериментальное укоренение микроспор абрикоса in vitro и in vivo. Состав наиболее удачного раствора для укоренения абрикоса содержал ингибиторы оксидазы КМП: кофейную и феруловую кислоты, а также ауксин. Побеги высотой 25-40 мм помещали в колбы или пробирки в среду для укоренения "2U65M2" и инкубировали в темноте в течение 7 дней при температуре 18-22˚C с 16-часовым периодом облучения.
Второй метод укоренения проводился в виде зеленых черенков, т.е. побеги, достигшие 25-40 мм в питательной среде, отделялись от морфогенетической зоны пластинкой и инкубировались в смеси ауксина 50 мг/л ИМК, 50 мг/л феруловой кислоты и 25 мг/л кофейной кислоты в течение 8 ч в темноте. Обработанные микрочеренки абрикоса были помещены в кассеты, содержащие смесь стерильного перлита, песка и торфа (2:1: 1) и инкубировали в микротермической теплице при температуре 18-22˚C и световом периоде 16 ч; через 1 месяц черенки были перенесены в горшки объемом 0,5 л, содержащие смесь торфа, нейтрального верхнего слоя почвы, перлита и речного песка в соотношении 1:1:2:2. Проращивание проводилось при температуре 22-24˚C и 16-часовом фотопериоде в стерильных условиях.
Хотя это только первый эксперимент по укоренению абрикоса in vitro, он показывает, что использование растворов ауксина с ингибиторами IUK-оксидазы является перспективным. Выход саженцев в горшках не превышал 10-15% при использовании любого из двух методов укоренения. В предыдущих опытах с черенками абрикоса с использованием того же состава выход укорененных саженцев составлял 30-35%. Укорененные саженцы Рубина Саратовского, выращенные в почве, зацвели на третий год и показали незначительную урожайность на пятый год.
Номер журнала Вестник науки №10 (67) том 2
Ссылка для цитирования:
Авакимян А.О. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И ИХ МОДИФИКАЦИИ ДЛЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ КРУПНОКОСТОЧКОВЫХ КУЛЬТУР (ПЕРСИК, АБРИКОС,СЛИВА) // Вестник науки №10 (67) том 2. С. 317 - 332. 2023 г. ISSN 2712-8849 // Электронный ресурс: https://www.вестник-науки.рф/article/10219 (дата обращения: 17.05.2024 г.)
Вестник науки СМИ ЭЛ № ФС 77 - 84401 © 2023. 16+