Савченко И.В.
ОБЗОР ПРИЛОЖЕНИЙ ХИТОЗАНА В МЕДИЦИНЕ И В ТЕХНОЛОГИИ БИООТОБРАЖЕНИЯ *
Аннотация:
многие актуальные проблемы сейчас связаны с загрязнением окружающей среды и биологических объектов токсичными веществами. В связи с этим остро стоит вопрос разработки эффективных биосовместимых адсорбентов красителей, пестицидов, гербицидов и мн. др. Относительно недавно стали проводиться исследования применения природного биосовместимого и биоразлагаемого полимера хитозана, который благодаря своим уникальным свойствам находит применение в медицине и экологии. Важный аспект химии хитозана - его способность к модификации, сшиванию и образованию наночастиц. В настоящей работе рассмотрены основные применения хитозана,а акцент сделан на его приложениях в технологии биоотображения
Ключевые слова:
природный полимер; хитозан; биоотображение; биосенсорика; хитозан в медицине; бисовместимость хитозана; функциональная модификация хитозана
УДК 547
Савченко И.В.
студент хим. факультета
Московский государственный университет
(г. Москва, Россия)
ОБЗОР ПРИЛОЖЕНИЙ ХИТОЗАНА В МЕДИЦИНЕ
И В ТЕХНОЛОГИИ БИООТОБРАЖЕНИЯ
Аннотация: многие актуальные проблемы сейчас связаны с загрязнением окружающей среды и биологических объектов токсичными веществами. В связи с этим остро стоит вопрос разработки эффективных биосовместимых адсорбентов красителей, пестицидов, гербицидов и мн. др. Относительно недавно стали проводиться исследования применения природного биосовместимого и биоразлагаемого полимера хитозана, который благодаря своим уникальным свойствам находит применение в медицине и экологии. Важный аспект химии хитозана - его способность к модификации, сшиванию и образованию наночастиц. В настоящей работе рассмотрены основные применения хитозана,а акцент сделан на его приложениях в технологии биоотображения
Ключевые слова: природный полимер; хитозан; биоотображение; биосенсорика; хитозан в медицине; бисовместимость хитозана; функциональная модификация хитозана
Введение [1]
Хитозан - линейный сополимер D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина, скрепленных между собой β(1-4)-связью (Рис.1). Соотношение мономеров глюкозамин: N-ацетилглюкозамин больше 1.
Рисунок 1: структура хитозана
Этот полимер найден в природе в составе клеточных стенок некоторых грибов, а также в панцирях ракообразных в виде ассоциатов с другими полисахаридами. Искусственно хитозан проще всего получить из хитина путем полного или частичного деацетилирования (гидролиза) последнего (Рис.2).
Рисунок 2: получение хитозана из хитина деацетилированием
Как и хитин, хитозан в твердом виде имеет кристаллическую структуру, сформированную листами из примыкающих друг к другу полимерных цепей за счет образования водородных связей. Существенное отличие от хитина состоит в том, что хитозан способен растворяться в слабокислой водной среде благодаря протонированию амино-групп при C(2), сказывающихся на взаимном отталкивании полимерных цепей и переходу их в раствор. Плотность положительного заряда (количество и пространственная удаленность протонированных амино-групп) при этом зависит от структурных особенностей вещества.
В природе хитозан может быть гидролизован белками-ферментами хитиназами, хитозаназами и лизоцимами. Кроме того, как и многие другие полисахариды, хитозан может гидролизоваться в кислой среде. Эти свойства обусловливают биоразлагаемость данного полимера.
Основные параметры хитозана как материала природного происхождения
Показано, что основные свойства хитозана определяются двумя параметрами - мольной долей N-ацетилглюкозамина (анлг. DA - degree of acetylation) и средней молекулярной массой полимера [2].
Мольная доля N-ацетилглюкозамина DA характеризует структуру хитозана, сказывающуюся на его растворимости, плотности заряда полимерных цепей в кислом растворе, кристалличности твердого образца и чувствительности к ферментам. Для определения DA могут привлекаться различные методы: элементный анализ, коллоидное титрование, адсорбция красителей, спектроскопия в ИК- и в УФ-области, спектроскопия ЯМР. Благодаря относительной легкости применения наряду с высокой точностью часто прибегают к использованию ИК-спектроскопии; метод основан на интерпретации данных о поглощении N-ацетил группой в инфракрасной области спектра [3].
В зависимости от источника и процедуры синтеза хитозан может иметь среднюю молекулярную массу в диапазоне 300-1000 кДа. Основными применяемыми способами ее определения служат капилярная вискозометрия, ультрацентрифугирование и эксклюзионная хроматография. При этом, несмотря на потенциальную точность этих методов, при измерении проблемой является склонность полимерных цепей хитозана к аггрегации в растворе [1].
Важный аспект хитозана - его биосовместимость с тканями организма, которая может сильно варьировать в зависимости от характеристик полимера. Так, было показано, что в образцах тканей пленки из хитозана с долей N-ацетилглюкозамина DA больше 16% вызывали локальное воспаление, а при DA около 4% практически никаких изменений не было обнаружено. Был сделан вывод об увеличении биосовместимости хитозана с уменьшением DA [4].
Аналогичные результаты были получены в исследовании клеточной совместимости вещества: культивирование разных типов клеток проходило тем лучше, чем меньше была доля N-ацетилглюкозамина. Исходя из возможности взаимодействия хитозана с интегрированными в клеточную мембрану белками была выдвинута гипотеза о прямом влиянии полимера на адгезию и пролиферацию клеток [1].
Модификация молекул хитозана. Наночастицы хитозана
В хитозане содержатся амино- и амидогруппы при атоме C(2), а также гидроксо-группы при атомах C(6) и C(3). Эти структурные фрагменты могут быть модифицированы для получения производных полимера с заданными свойствами. В частности, т.н. привитая сополимеризация широко используется для введения боковых цепей с целью получения гибридного материала, включающего в состав природные полисахариды и синтетические полимеры [5].
Микро- и наночастицы из полимерных молекул хитозана могут быть получены различными методами. Наиболее часто применяется метод т.н. ионотропного гелеобразования в присутствии таких ионов, как трифосфат или сульфат. Процедура включает в себя добавление раствора соли (сульфата, трифосфата и др.) к подкисленному раствору хитозана при механическом или ультразвуковом воздействии. От условий при этом сильно зависит размер итоговых частиц [6].
Полученные таким способом наночастицы потенциально могут включать в себя некторые биологические молекулы, такие как нуклеиновые кисллоты, ферменты, а также лекарственные препараты, на чем основано применение хитозана в методах эффективной и точечной доставки лекарственных препаратов [7].
Для модификации свойств полимера широко используется его сшивание с другими полимерными молекулами. Связывание может осуществлятся как с самим хитозаном, так и с с отличными от него высокомолекулярными веществами. Разработаны также методы получения т.н. полупроникающих сетей, состоящих из гибридной полимерной структуры хитозана и запутанных в ней молекул другого несвязанного ковалентно полимера.
Непосредственно для сшивания могут использоваться диальдегиды, например глутаральдегид [8]. Однако их применение сильно ограничено из-за высокой токсичности, поэтому более широкое распространение в технике связывания макромолекул получил сшивающий агент природного происхождения - генипин, который практически не обладает токсичностью.
Приложения хитозана. Использование наночастиц хитозана в технологии биоотображения
Хитозан и его производные могут эффективно применяться во многих областях, тесно связанных с живыми организмами. Наиболее перспективным является сейчас разработка и внедрение материалов, основанных на хитозане, в медицину, что обусловлено рядом его свойств. Так, давно доказано его гемостатическое действие, способность стимулировать пролиферацию клеток, иммуноадъювантное свойство и др. Кроме того, благодаря возможности формирования микро- и наночастиц хитозан находит применение в разработке эффективных методов капсулирования и доставки лекарств.
Большое значение сейчас имеет сейчас исследование биохимических процессов, протекающих в клетках и тканях, с помощью т.н. биоотображения - применения агентов, способных связываться только с определенными компонентами клеточной системы, и имеющие метку, благодаря чему можно в итоге отслеживать наличие того или иного компонента и оценивать его содержание. Важный пласт такой технологии составляют методы, привлекающие флуоресцирующие метки.
Благодаря биосовместимости и способности сорбировать многие молекулы, в частности флуорофоры, наночастицы хитозана могут заполнить нишу технологии биоотображения.
В работе [9] были получены наночастицы хитозана (сферической формы, диаметром менее 20 нм) путем ионотропного гелеобразования в присутствии TPP. Эти частицы затем были помечены флуоресцеин-5-изотиационатом (FITC). Была показана высокая биосовместимость и флуоресцентная активность полученных наночастиц, которая была продолжительней, чем таковая у свободного флуорофора (Рис.3).
Рисунок 3: (а) реакция связывания метки флуорофора FITC с хитозаном; (б) спектры поглощения (А) и испускания (Б) наночастиц; (в) микрофотография частиц, полученная с помощью флуоресцентного микроскопа; (г) графики изменения интенсивности во времени флуоресценции помеченых наночастиц (А) и чистого флуорофора (В)
В похожей работе [10] были успешно синтезированы наночастицы хитозана, сшитого с лектином (Рис.4а). Благодаря метке в виде FITC, наночастицы показывали сильной флуоресценцией; при этом отмечено, что такая эмиссия света была более устойчивой, чем в случае свободного флуорофора, исходя из зависимости интенсивности флуоресценции от времени (Рис.4д)
Рисунок 4: (а) схема получения наночастиц хитозана сшитых с биотинилированным фитогемагглютинином, и меченых флуорофором FITC; (б) микрофотография частиц, полученная с помощью флуоресцентного микроскопа; (в) спектр испускания чистого флуорофора; (г) спектр испускания полученных частци; (д) изменение интенсивности флуоресценции во времени чистого флуорофора (а) и помеченых наночастиц на основе хитозана (b)
В исследовании [11] были получены системы прекрестно-сшитых при помощи глутаральдегида магнитных наночастиц хитозана. Магнитная активность была обусловлена наличием частиц Fe3O4 внутри структур из хитозана. Были исследованы адсорбционные свойства полученных наночастиц на примере двух пищевых красителей - бриллиантовый голубой и тартразин. Ацент был сделан на изучении физико-химических аспектов процесса адсорбции. Были исследованы кинетические и термодинамические параметры, свидетельствующие о сильном влиянии на эффективность адсорбции концентрации глутаральдегида, концентрации красителей и pH среды.
Рисунок 5: графики зависимости при разных температурах степени адсорбции красителей бриллиантового голубого (а) и тартразина (б) наночастицами на основе хитозана в зависимости от концентрации красителя
В работе [12] были получены наночастицы (сферической формы с диаметром менее 26 нм) в микроэмульсии циклогексан-вода в присутствии н-гексанола и поверхностно-активного вещества Triton X-100, а также винной кислоты для перекрестного сшивания молекул полимера. Синтезированные частицы были растворены в 1% растворе уксусной кислоты и помечены флуорофором FITC. Возможность их применения в биоотображении была доказана на примере специфеческого связывания в раковых клетках крови человека (Рис.6).
Рисунок 6: Конфокальные изображения лазерного сканирования (слева: флуоресцентное изображение, справа: просвечивающее изображение) раковых клеток крови человека, меченных конъюгатами наночастиц на основе хитозана с биологическими молекулами
Успешных результатов по получению флуоресцирующих наночастиц на основе хитозана удалось добиться в работе [13], в которой было выполнено перекрестное сшивание полимерных молекул хитозана с помощью сшивающего агента EP3 (Рис. 7а), обладающего также и свойствами флуорофора. Полученные частицы показывали устойчивую и продолжительную во времени флуоресцению. Была доказана хорошая биосовместимость наночастиц на основе хитозана и их реализация в технологии биоотображения на примере клеток легочного эпителия (Рис. 7д).
Рисунок 7: (а) схема сшивания полимерных молекул хитозана с помощью флуорофора EP3; (б) просвечивающее изображение полученных наночастиц; (в) спектры поглощения и эмисси света наночастицами; (г) спектр флуоресценции ннаночастиц в зависимости от времени, прошедшего с момента их получения; (д) изображение маркированных частицами клеток легочного эпителия при возбуждении светом с длиной волны 405 нм
Таким образом, хитозан может эффективно применяться как основной структурный материал наночастиц, способных связываться со специфическими биомолекулами при реализации технологии биоотображения. Развитие данного направления может открыть новые пути в прикладной области клинических исследований и в фундаментальной области изучения механизмов протеканиябиохимических реакций.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
Номер журнала Вестник науки №6 (63) том 1
Ссылка для цитирования:
Савченко И.В. ОБЗОР ПРИЛОЖЕНИЙ ХИТОЗАНА В МЕДИЦИНЕ И В ТЕХНОЛОГИИ БИООТОБРАЖЕНИЯ // Вестник науки №6 (63) том 1. С. 1240 - 1254. 2023 г. ISSN 2712-8849 // Электронный ресурс: https://www.вестник-науки.рф/article/8739 (дата обращения: 19.05.2024 г.)
Вестник науки СМИ ЭЛ № ФС 77 - 84401 © 2023. 16+