Савченко И.В.
ОБЗОР ВРЕМЯ-РАЗРЕШЕННОГО ФЛУОРОИММУНОХИМИЧЕСКОГО МЕТОДА АНАЛИЗА TRFIA *
Аннотация:
иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом взаимодействии антигенов со специфическими антителами, прочно вошли в аналитическую практику. Они обладают высокой чувствительностью, специфичностью, требуют минимального количества исследуемого материала, позволяют получить количественные, объективные результаты. Иммуноанализ используют с диагностическими целями практически во всех областях медицины, а также в ветеринарии. Методы иммуноанализа с успехом применяют в молекулярной биологии, микробиологии, физиологии для изучения живых систем на всех уровнях. На данный момент очень широкое распростронение получили иммуноферментые подходы к проведению исследований, среди которых выделяется радиоиммунный анализ твердофазный иммуноферментный анализ (англ. ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay). Однако сейчас начинает разрабатываться метод флуороиммунохимического анализа (англ. TRFIA - time-resolved fluoroimmunoassay), имеющий ряд преимуществ. В настоящей работе представлен обзор данного метода и приведено сравнение с ELISA, показывающее его большую эффективность
Ключевые слова:
аналитическая химия, иммунохимические методы, время-разрешенный флуороиммунохимический анализ, эффективность TRFIA, определение загрязнителей окружающей среды, определение антибиотиков, определение лекарств
УДК 57.083.34
Савченко И.В.
студент хим. факультета
Московский государственный университет
(г. Москва, Россия)
ОБЗОР ВРЕМЯ-РАЗРЕШЕННОГО
ФЛУОРОИММУНОХИМИЧЕСКОГО
МЕТОДА АНАЛИЗА TRFIA
Аннотация: иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом взаимодействии антигенов со специфическими антителами, прочно вошли в аналитическую практику. Они обладают высокой чувствительностью, специфичностью, требуют минимального количества исследуемого материала, позволяют получить количественные, объективные результаты. Иммуноанализ используют с диагностическими целями практически во всех областях медицины, а также в ветеринарии. Методы иммуноанализа с успехом применяют в молекулярной биологии, микробиологии, физиологии для изучения живых систем на всех уровнях. На данный момент очень широкое распростронение получили иммуноферментые подходы к проведению исследований, среди которых выделяется радиоиммунный анализ твердофазный иммуноферментный анализ (англ. ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay). Однако сейчас начинает разрабатываться метод флуороиммунохимического анализа (англ. TRFIA - time-resolved fluoroimmunoassay), имеющий ряд преимуществ. В настоящей работе представлен обзор данного метода и приведено сравнение с ELISA, показывающее его большую эффективность.
Ключевые слова: аналитическая химия, иммунохимические методы, время-разрешенный флуороиммунохимический анализ, эффективность TRFIA, определение загрязнителей окружающей среды, определение антибиотиков, определение лекарств
Основу иммунохимического анализа составляет способность антител образовывать прочные высокоспецифичные комплексы с определенными антигенами (гаптенами). Реакция «антиген – антитело» проходит в строго количественном соотношении и используется в анализе для определения одного из этих реагентов. Измеряя количество антигена, который провзаимодействовал или не провзаимодействовал с антителами (либо наоборот), зная кинетику процесса иммунной реакции, можно рассчитать количество искомого анализируемого вещества.
Все иммунохимические методы анализа можно разделить на конкурентные, при которых используется недостаток антител по отношению к аналиту, и неконкурентные, в случае которых антитела присутствуют в избытке [1].
Метки в иммунохимии относятся к соединениям, которые химически присоединены к одному из реагентов для анализа с целью определения концентрации этого реагента. Это позволяет обнаружить и измерить содержание комплекса антиген-антитело. Метки могут быть ковалентно прикреплены либо к антигену (гаптену), либо к антителу. Обычно они представлены в виде радиоизотопов, ферментов, других белков, флуоресцентных молекул, люминесцентных молекул или фагов. В зависимости от природы применяемой метки и способа ее детекции существует несколько видов иммунохимического анализа: иммуноферментный, иммунохроматографический и иммуносенсорный методы [1].
Важное семейство иммуносенсорных методов привлекает явление флуоресценции. При прямом иммунофлуоресцентном методе меченые антитела вступают в реакцию с образцом, содержащим антиген (Рис.1). Метод непрямого иммунофлуоресцентного анализа включает сначала реакцию немеченых антител с образцом, содержащим антиген, с последующей реакцией с антителом, меченным флуоресценцией, которое функционирует аналогично конъюгату фермент-антитело, используемому в иммуноферментном анализе.
Рисунок 1 - реализация прямой и непрямой флуоресценции при проведении иммунохимического анализа
В методе время-разрешенной флуориметрии длительность испускания света измеряется после моментальных последовательных возбуждений. Природа измеряемой флуоресценции зависит от свойств возбужденного флуорофора. В этом отношении важны следующие два параметра: энергия возбуждения, которая определяет длину волны излучаемого света, и скорость передачи энергии во флуорофоре, которая влияет на время жизни излучения. При применении в качестве технологии количественного определения флуорофора с максимально возможной чувствительностью флуориметрия с временным разрешением позволяет разделить компоненты излучения с быстрым и длительным затуханием. Продолжительное излучение при этом отделяется от фонового сигнала, который часто обусловлен процессами кратковременного затухания флуоресценции и рассеяния.
В автоматическом флуориметре с микросекундным временным разрешением при возбуждении используется ксеноновая лампа. Излучение измеряется с помощью фотоумножителя путем подсчета фотонов. По истечении определенного времени с момента возбуждения инициируется подсчет фотонов. Частота вспышки, общее время измерения, а также задержка и время счета могут варьироваться, но обычно общее время измерения составляет 1 с, что составляет 1000 отдельных циклов, в течение которых подсчитывается общее количество фотонов [2].
Преимущество режима измерения с временным разрешением во флуориметрии заключается в существенном снижении уровня фонового сигнала, последующем увеличении отношения сигнал/шум и, как следствие, повышении чувствительности. Основными источниками фоновой флуоресценции в биологических и биохимических образцах являются "автофлуоресценция" и рассеяние. Поскольку время жизни флуоресценции биоорганических молекул очень короткое, излучение от этих источников появляется одновременно с возбуждением. Выбрав подходящий промежуток времени между возбуждением и началом подсчета фотонов, можно полностью исключить короткую, быстро затухающую флуоресценцию, и специально подсчитать долгоживущее излучение, исходящее от выбранного флуорофора (Рис.2). На этом принципе основано использование хелатов лантанидов во флуориметрии с временным разрешением для уменьшения фонового сигнала и заметного повышения чувствительности [3].
Рисунок 2 - график динамики флуоресценции с разными временами жизни, иллюстрирующий возможность детектирования и измерения излучения флуорофора (на графике TRF - англ. time-resolved fluorescence) отдельно от “шума” в виде эмиссии света другими компонентами системы (т.н. короткоживущая флуоресценция)
Использование хелатов Eu3+ в флуориметрии
На флуоресцентные свойства ионов лантанидов большое влияние оказывает химическое окружение иона [3]. Большинство неорганических солей проявляют чрезвычайно слабую флуоресценцию, поскольку поглощение иона очень низкое. Ситуация полностью меняется, когда ион хелатируется соответствующими органическими лигандами, хотя излучение исходит от лантанида, органический лиганд играет важную роль. Флуоресценция протекает в ходе следующих фаз (Рис.3):
Флуоресценция комплексов конкурирует с параллельно-происходящими безызлучательными энергетическими переходами. Такие переходы, как фосфоресценция и флуоресценция лиганда, снижают эффективную эмиссию металла и должны быть сведены к минимуму, если необходима высокая чувствительность измерений.
Рисунок 3 - механизм появления флуоресценции комплексов лантанидов
Длительность и интенсивность излучения зависят от химического окружения и, следовательно, от свойств лиганда. На все эти характеристики влияют природа иона, природа лиганда, характер связи между металлом и лигандом, а также характер взаимодействия комплекса с молекулами, находящимися в растворе. Изменения в химическом окружении иона могут сильно влиять на время и интенсивность излучения. Чувствительность измерения зависит от структуры лигандов и химического состава среды, в которой выполняется измерение.
Было исследовано большое количество различных хелатов лантанидов, чтобы объяснить влияние лиганда на интенсивность ионной флуоресценции. Наиболее часто используемый лиганд имеет структуру β-дикетона. Было показано, что различные конъюгаты β-дикетонов хелатируют ионы лантанидов и одновременно функционируют как возбуждающие лиганды [4]. Исходя из этого, можно сделать вывод, что структура функциональных групп в лиганде влияет как на интенсивность флуоресценции, так и на ее продолжительность.
Свойства растворителя также оказывают значительное влияние на флуоресценцию ионов. В водном растворе, например, легко может происходить “гашение” излучения, при котором часть энергии возбужденного комплекса передается молекулам воды в виде теплоты. Поскольку для иммунохимических применений требуется количественное определение лантанида в водном растворе, в этом случае необходима среда для измерения, в которой возбужденный хелат защищен от возможного “гашения” молекулами воды.
В зависимости от лантанида структура лигандов и химический состав водного раствора варьируются, если требуется оптическая чувствительность к флуоресценции данного иона. Для измерения содержания европия в качестве хелатирующего лиганда часто используется 2-нафтоилтрифторацетон (NTA). Поверхностно-активные вещества, например Triton X-100, иногда добавляются для удержания хелата европия в мицеллах, что защищает его от взаимодействия с молекулами воды (Рис.4). При этом часто добавляют три(н-октил)фосфин оксид (TOPO) для стабилизации хелата в мицеллярной структуре. В таком водном растворе европий измеряется методом флуориметрии с временным разрешением с очень высокой чувствительностью [3].
Рисунок 4 - Схематическое изображение мицеллы образованной Triton X-100 и хелата Eu3+ в комплексе с NTA и TOPO внутри мицеллы, образованной Triton X-100 в водном растворе
Помимо европия лантаниды Sm3+, Tb3+ и Dy3+, которые также обладают интенсивной флуоресценцией, могут быть количественно определены в соответствующих экспериментальных условиях. Однако применение именно хелатов Eu3+ является оптимальным, поскольку они отличаются достаточно высоким квантовым выходом, узким пиком эмиссии света и возможностью изменения длины волны поглощения за счет варьирования лигандов. Аналогичные комплексы Tb3+, которые также пробовали использовать в этом методе, обладают недостатком в лице высокой энергии возбуждения при λ<300 нм, из-за чего сильно ограничивается использование в анализе пластмассы и стекла, эффективно поглощающих в этом диапазоне [1].
Флуориметрия с временным разрешением уже давно применяется как в клинических, так и в научных исследованиях.
Основные биотехнологические приложения флуоресценции лантанидов и их хелатов с временным разрешением [5,6]:
В начале 1980-х годов был разработан метод время-разрешенного флуороиммунологического анализа (TRFIA - time-resolved fluoroimmunoassay) [7]. С помощью TRFIA можно эффективно исследовать объекты на содержание различных гаптенов, белков, гормонов, вирусных частиц и т.п. Результаты анализов прямой и непрямой гибридизации также показали, что хелаты европия в качестве меток и флуоресцентная детекция с временным разрешением представляют собой многообещающую альтернативу радиоизотопам при мечении нуклеиновых кислот. Внедрение гибридизационных анализов в клиническую практику частично зависит от возможного упрощения процедур анализа, а частично от наличия удобной и чувствительной неизотопной метки. Согласно существующим исследованиям, хелаты лантанидов, вероятно, будут использоваться для прямого мечения нуклеиновых кислот, а также олигонуклеотидов.
При маркировке антител хелатами необходимо учитывать множество факторов для проведения оптимального анализа. Связывание метки не должно вызывать каких-либо эффектов в отношении иммунореактивности антитела, его растворимости, стабильности, аффинности и специфичности. Перед нанесением маркировки ионом лантанида он должен быть прочно хелатирован подходящим бифункциональным хелатирующим агентом. Для использования и хранения хелатов в разбавленных растворах требуется высокая термодинамическая стабильность; требуется также и кинетическая инертность комплекса, поскольку любые ионы металлов и лиганды в образцах могут оказаться критичными для анализа [5]. Хорошая растворимость в воде и мягкие условия маркировки обеспечивают высокие константы связывания при сохранении активности антител. Для получения флуоресцентных антител хелатирующая группа должна также содержать группы, поглощающие ультрафиолетовый свет, способные передавать при возбуждении энергию хелатированному лантаниду. Известно, что единственной группой хелатирующих агентов, образующих хорошо растворимые и стабильные хелаты лантаноидов, являются комплексоны, полиаминополиуксусные кислоты. Соединения, подобные EDTA, DTPA, DOTA и TETA образуют наиболее стабильные хелаты [8].
Для измерения содержания лантанида в виде соответствующего хелата, таким образом, нужно, чтобы он был прочно связан в комплекс и обладал характерной флуоресценцией. Хотя эти две проблемы могут быть решены с помощью лишь одной молекулярной структуры, их разделение иногда предпочтительно для разработки методов иммуноанализа [8]. В флуороиммунологическом анализе с “усиленной” диссоциацией (DELFIA - dissociation-enhanced lanthanide fluorescence immunoassay) лантанид связывается с одним из иммунокомпонентов в нефлуоресцентной форме. После завершения твердофазной иммунореакции часть меченого компонента (антитела или антигена) связывается с поверхностью. Разделение свободной и связанной фракций осуществляется путем тщательной промывки твердой фазы. Наконец, ион лантанида быстро диссоциирует из иммунокомпонента в твердой фазе в водный раствор, где образуется хелат, имеющий высокую флуоресценцию. Флуоресценция количественно определяется с высокой чувствительностью с помощью флуориметрии с временным разрешением.
Преимущество метода DELFIA заключается в том, что он облегчает выбор подходящей лиганда для флуоресцентного хелата, поскольку требование стабильности не столь важно по сравнению с хелатом, используемым в составе иммунокомпонента. Кроме того, измерение флуоресценции осуществляется в растворе, а не на твердой фазе, что удобно как с точки зрения химических, так и инструментальных факторов. Однако этап диссоциации в анализе несколько увеличивает риск фонового загрязнения в итоговом измерении флуоресценции.
При использовании катиона лантанида в качестве метки необходимо, чтобы он был связан в кинетически стабильной форме с иммунокомпонентом. Для получения необходимой стабильности обычно используются иммунокомпоненты с ЭДТА и ДТФА-подобных хелатообразующих структур, константы устойчивости комплекса при этом составляют порядка от 1016 до 1022 [9]. Подходящие производные соответствующих соединений могут быть ковалентно связаны с антителами, эффективно хелатируя лантанид в составе иммунокомпонентом в нефлуоресцентной форме. Реакции связывания контролируются путем регулирования условий таким образом, чтобы на молекулу антитела приходилось желаемое количество хелатов лантанидов. Избыток хелатного комплекса удаляют путем хроматографического разделения на колонке.
Различные гаптены могут быть помечены эффективно хелатирующими производными поликарбоновой кислоты, точная молекулярная структура которой определяется для каждого случая отдельно. Конечным продуктом является гаптен, прочно связанный с практически нефлуоресцирующим ионом лантанида [1].
Стабильность хелатов лантанидов на основе поликарбоновой кислоты зависит от константы связывания. Ионы лантанидов в этом случае легко отделяются от иммунокомпонентов, меченных нефлуоресцентной меткой, путем снижения рН. Обычно это достигается добавлением буферного водного раствора с рН 3,2, содержащего β-дикетон, неионогенное смывающее средство и синергетический агент. Одновременно ион лантанида образует новый флуоресцентный хелат.
При обсуждении характеристик эффективности различных стратегий иммуноанализа важно понимать, что решающее различие заключается не в особенности меченого антитела или меченого аналита, а в неконкурирующих и конкурирующих системах. Соответственно, были определены четыре альтернативные стратегии иммуноанализа:
Вариации 1-3 предполагают использование оптимальных концентраций антител, стремящихся к нулю, и называются конкурентными анализами (анализами насыщения). Вариант 4 подразумевает высокую концентрацию антител по отношению к количеству присутствующего анализируемого вещества и называется неконкурентным анализом (реагент-избыточным).
Конкурентные анализы проводятся либо с использованием меченых аналитов (гаптенов), либо с использованием меченых антител. Обе схемы анализа дают максимальную чувствительность, когда концентрация антител приближается к нулю. Когда метод флуоресценции с временным разрешением был применен к конкурентным твердофазным анализам, были измерены только гаптены, но как антитело, так и альтернативы, меченные гаптеном, были протестированы с использованием хелатов европия в качестве меток.
Чаще всего применяют меченое антитело (Рис.5). Гаптен иммобилизуют с помощью белкового носителя в лунках полистирольной полоски для микротитрования. В ходе анализа стандарт или образец вводится пипеткой в лунку, и иммунореакция инициируется добавлением антитела, меченного хелатом европия. Когда иммунореакция завершена, лунку тщательно промывают. Европий, связанный с твердой фазой, диссоциируется добавлением т.н. “улучшающего раствора” (англ. enhancement solution) и измеряется методом флуориметрии с временным разрешением. “Улучшающий раствор” содержит соединения, необходимые для образования хелата европия с высокой флуоресценцией (хелатирующие лиганды). Конечный результат получается путем распределения меченого антитела между эндогенным гаптеном в образце или стандарте и экзогенным гаптеном, связанным с твердой фазой. Согласно общепринятой терминологии, процедуру можно назвать иммунометрической, поскольку она основана на маркировке специфического антитела вместо анализируемого вещества (гаптена).
Рисунок 5 - схема проведения конкурентного анализа с помощью TRFIA
Чувствительность конкурентного анализа
Максимальная достижимая чувствительность (ε) конкурентного анализа определяется по формуле:
,
где - относительная погрешность измерения светового отклика R, а K - константа сродства к антителу. Погрешность измерения отклика содержит две составляющие: экспериментальную погрешность и погрешность измерения сигнала. Предполагая, что погрешность измерения сигнала равна нулю, задается максимальная потенциальная чувствительность:
Максимальная чувствительность =
где ϵ - относительная погрешность отклика, обусловленная только экспериментальными ошибками. Таким образом, если используется антитело с константой сродства 1012 и предполагается, что погрешность эксперимента составляет 1%, максимальная чувствительность составляет 10-14 моль/л.
Преимущества и ограничения конкурентного анализа
Одно из преимуществ обусловлено особенностями покрытия из твердой фазы. Методика анализа не требует покрытия антителами, поскольку здесь используется стабильный конъюгат гаптен-белок. В то же время здесь есть и некоторые ограничения. Протеин-носитель для конъюгата гаптен-белок не должен вызывать каких-либо неспецифических реакций с твердой фазой. Равномерное нанесение покрытия имеет решающее значение для точности анализа. В конкурентных анализах, использующих меченые антитела, можно избежать возможных проблем, связанных с мечением различных молекул гаптена. Аналогичные условия реакции применяются для маркировки различных препаратов антител. Анализ достаточно практичен, поскольку необходимо добавлять только стандарт (или образец) и меченое антитело, а разделение осуществляется простой, но эффективной промывкой твердой фазы. Конструкция анализа также позволяет использовать непрямой метод проведения иммунореакции. В этом случае требуется дополнительная стадия инкубации, зато при этом один и тот же препарат меченых антител может быть применен для анализа на разные гаптены.
В случае, когда конкурентный твердофазный анализ проводится с применением меченого гаптена, практическое выполнение анализа так же просто, как и при использовании меченого антитела. Равномерное нанесение покрытия также имеет решающее значение для точности. Кроме того, маркировка для гаптенов должна быть подобрана для каждого образца отдельно.
Альтернативой для преодоления возникающих время от времени трудностей с нанесением покрытия и сопутствующей проблемы точности при проведении твердофазных конкурентных анализов является непрямое нанесение покрытия на твердую фазу, которое может быть нанесено как для анализов, меченных антителами, так и для анализов, меченных гаптеном. При таком подходе связывающая способность твердой фазы является избыточной.
Большое количество различных неконкурентных твердофазных анализов, основанных на флуоресценции с временным разрешением, проводится с использованием моноклональных антител и лунок для микротитрования полистирольной полоски в качестве твердой фазы.
Анализ может проводиться в два этапа или в один. В ходе двухэтапной процедуры антигену сначала дают вступить в реакцию с моноклональным антителом, иммобилизованным на лунке. После соответствующего времени инкубации лунку промывают и добавляют меченое моноклональное антитело, которое реагирует со связанным антигеном. После второй стадии инкубации разделение в пробирке осуществляется за счет эффективной промывки лунок, что уменьшает погрешность определения неспецифического связывания. На заключительном этапе добавляют “улучшающий раствор” и проводят считывание показаний с помощью флуориметра с временным разрешением. В случае одноэтапной процедуры все реагенты, стандарт или образец, содержащий антиген, и меченое моноклональное антитело вводятся в лунку одновременно, и требуется только один соответствующий этап инкубации.
Чувствительность неконкурентного анализа
Максимальная чувствительность (ε) неконкурентного иммуноанализа определяется соотношением:
,
где - относительная ошибка в оценке флуоресценции в отсутствие анализируемого вещества (т.е. ошибка в оценке неспецифически связанного антитела), k - доля неспецифического связывания антитела и K - константа сродства к антителу. Если используется антитело с константой сродства 1012, составляет 1%, и доля неспецифического связывания антитела равна 1%, то максимальная потенциальная чувствительность в случае неконкурентной системы иммуноанализа составляет 10-16 моль/л. Как видно, использование неконкурентных систем при анализе дает лучшую чувствительность, чем при конкурентных анализах.
Преимущества и ограничения неконкурентного анализа
Неконкурентный дизайн анализа имеет несколько преимуществ, но также и некоторые недостатки, которые в основном связаны с необходимой степенью чистоты и требуемым количеством антител.
Основным преимуществом является очень высокая специфическая активность метки, которая дает возможность в полной мере использовать потенциал чувствительности анализа. Хотя особенности метки еще не полностью могут обеспечить высокую чувствительность, по крайней мере, она может стать определяющим фактором этого потенциала при условии, что остальные компоненты подобраны оптимально.
Неконкурентный метод анализа также называется реагент-избыточным, поскольку он основан на использовании концентраций антител, которые являются высокими по отношению к количеству присутствующего анализируемого вещества. Максимальная чувствительность достигается, когда концентрация антитела достаточно велика, в том случае, если неспецифическое связывание может поддерживаться на незначительном уровне. Соответствие теории, предсказывающей высокую чувствительность метода, возможно при использовании флуоресценции с временным разрешением. Более того, когда используется большой избыток меченого антитела в сочетании с меткой, которая может быть количественно определена с очень широким динамическим диапазоном и высокой чувствительностью, диапазон измерений анализа становится чрезвычайно широким.
Ограничением, вызванным высокой концентрацией антител и специфической активностью метки, является необходимость тщательной промывки после последней стадии разделения в анализе. Относительная погрешность в оценке неспецифического связывания увеличивается, если промывка проводится не полностью. Это относится ко всем неконкурентным анализам, но ошибка становится более критичной в очень чувствительных анализах с применением меток с высокой активностью.
Одним из важных преимуществ меток с лантанидами является хорошо сохраняющаяся иммунореактивность после того, как антитело метится соответствующим хелатным комплексом. Маркировка иммунокомпонента, таким образом, является достаточно щадящей процедурой с незначительным влиянием на характеристики антитела. Это свойство позволяет наносить значительное количество метки на каждую молекулу антитела, не влияя на его иммунохимические характеристики, что, опять же, выгодно для получения оптимальной чувствительности метода.
Спектр приложений метода TRFIA к исследованию биологических объектов
С увеличением масштабов производства и ростом уровня жизни возрастает роль и необходимость тщательного контроля качества различных потребительских продуктов, а также мониторинга состояния окружающей среды. Остро стоит вопрос предотвращения попадания в продукты питания нежелательных биогенных и небиогенных веществ, таких как пестициды, гербициды и продуцируемые микроорганизмами токсиканты. С ростом уровня медицины возникает необходимость применения оптимальных методов контроля уровня лекарственных веществ как в организме пациента, так и в окружающей среде. Помимо этого из-за риска вспышек различных заболеваний и расширения клинических методов лечения встает вопрос об оптимальном проведении анализа биологических объектов. Иммунохимические методы, в частности TRFIA, могут стать инструментом решения этих актуальных проблем [10].
Метод TRFIA на данный момент только начинает привлекать внимание как инструмент количественного анализа и его использование в описанных ниже работах мотивировано, как правило, интересом и желанием к разработке метода.
В обзоре рассматриваются недавно-опубликованные исследования, привлекающие метод время-разрешенного флуороиммунохимического анализа. При сравнении эффективности разных подходов к измерению концентрации аналита в образце важны два параметра - нижний предел детектирования, показывающий минимальную уловимую концентрацию аналита, и т.н. линейный диапазон измерений - промежуток концентрации, при котором экспериментальные данные линеаризуются и могут интерпретироваться для расчета.
Мониторинг состояния окружающей среды
В работе [11] метод время-разрешенного непрямого конкурентного флуороиммунологического анализа сыграл ключевую роль в определении следов загрязнителей в природных водах. Группа исследователей развила подход к количественному анализу пестицидов, отходов производства, лекарственных препаратов в почве и в водах; результаты показали хорошую точность и воспроизводимость в полевых условиях, при том было показано, что предел детектирования в случае ELISA меньше, чем в случае TRFIA. Здесь же подчеркнута быстрота, относительная легкость, экономическая доступность и вместе с тем чувствительность использования метода при мониторинге состояния окружающей среды. В этой связи отмечено, что TRFIA не требует предварительного приготовления образцов и для него достаточно небольшое их количество.
В работе [12] была исследована эффективность методов TRFIA и ELISA в применении к количественному анализу на квинклорак - гербицид, легко накапливающийся в почве. Исследователями была поставлена задача применить иммунохимические методы методы ELISA и TRIFA и сравнить их эффективность между собой, а также с очень чувствительным методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией (UPLC-MS/MS). Сначала анализу подверглись специально полученные образцы квинклорака и ряда его структурных аналогов. Была показана высокая специфичность использовавшихся антител именно к квинклораку. Метод непрямого конкурентного TRFIA с меткой в роли хелатного комплекса Eu3+ в применении к анализу концентрации аналита дал лучшую корреляцию данных по сравнению с ELISA. Значения нижнего предела измерения (IC20) для TRFIA и для ELISA составили 16,53 и 82,26 нмоль/л соответственно. Линейный диапазон измеряемых концентраций (IC20-IC80) для TRFIA и для ELISA составил 16,53 - 7690 и 82,26 - 5740 нмоль/л соответственно. Таким образом, данные показали 5-ти кратное уменьшение нижнего предела детектируемой концентрации аналита и расширение в 1,3 раза диапазона точного измерения при использовании TRFIA в сравнении с ELISA. Исследование природных образцов на содержание гербицида показало хорошую корреляцию измерений TRFIA с UPLC-MS/MS, что также может свидетельствовать о высокой чувствительности метода.
Анализ продуктов питания на токсины
Работа [13] посвящена исследованию образцов моллюсков на содержание окадаиновой кислоты, которая иногда является причиной отравлений при употреблении морских продуктов. Анализ проводился с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и непрямого конкурентного TRFIA c меткой в виде хелатного комплекса Eu3+. Сначала с помощью искусственных образцов была доказана высокая специфичность использованных антител именно к окадаиновой кислоте. Затем уже были исследованы образцы моллюсков с помощью двух разных методов. Проведенные измерения показали нижний предел измеряемой концентрации аналита метода TRFIA 3,093*10-3 нмоль/л, что почти в 5 раз ниже соответствующей величины, определенной для ELISA, равной 0,015 нмоль/л; линейный диапазон измерений лежал в промежутке 3,093*10-3- 62,112 нмоль/л, который в 68 раз шире, чем линейный диапазон для ELISA: 0,025-0,932 нмоль/л. Сравнение результатов с HPLC подтвердило высокую точность TRFIA.
В работе [14] представлен анализ пищевых продуктов на содержание афлтатоксинов - семейства микотоксинов, продуцируемых микромицетами, поражающими корма для скота и продукты растительного происхождения. Сначала было проведено исследование специфичности использованных антител к конкретному аналиту. После проводился уже сам анализ, а данные, полученные с помощью непрямого конкурентного время-разрешенного флуороиммунологического метода с меткой в виде хелатного комплекса Eu3+ сравнивались с аналогичными данными, полученными с привлечением других методов, в частности ELISA [15]. Были проведены точные измерения содержания афлатоксина B1 и показана более высокая чувствительность TRFIA в сравнении с ELISA.
Похожее исследование [16] посвящено определению чрезвычайно токсичного для эукариот микотоксина Т-2, продуцируемого плесневыми грибами, поражающих зерновые культуры и корма для скота. Для достижения высокой чувствительности был выбран метод непрямого конкурентного время-разрешенного флуороиммунологического анализа с меткой в виде комплекса Eu3+ с поликарбоновой кислотой. Были взяты несколько образцов растительных культур. Так, лучшая чувствительность была продемонстрирована на измерении содержания аналита в образцах риса - нижний предел измерения составил 0,193 нмоль/кг, а линейный диапазон измерений лежал в промежутке 0,268-428,7 нмоль/кг. В похожем исследовании для аналогичного образца, но при использовании ELISA, был достигнут нижний предел детектирования, равный 12,43 нмоль/кг [17], что в 64 раза больше соответствующей величины для TRFIA. Была подчеркнута легкость и быстрота применяемого метода, наряду с высокой точностью и чувствительностью измерений, которая превосходит чувствительность ELISA.
Анализ на антибиотики
Важное приложение иммунохимических методов - количественный анализ антибиотиков в продуктах питания, в частности в молочных продуктах, поскольку это связано с проблемой резистентности возбудителей заболеваний к лекарственным препаратам. В работе [18] был успешно использован метод непрямого конкурентного TRFIA с меткой в виде хелатного комплекса Eu3+ в применении к анализу содержания антибиотиков в молоке. С помощью антител, специфичных к антибиотику стрептомицину проводилось определение его содержания в образцах. Нижний предел детектирования и линейный диапазон TRFIA при этом составил 0,327 нмоль/л и 0,55-8,59 нмоль/л соответственно. Для сравнения, работе, посвященной измерению концентрации стрептомицина в молоке с помощью ELISA, был достигнут нижний предел, равный 0,413 нмоль/л [19].
Сравнение с другими методами подчеркивает оптимальность TRFIA при анализе пищевых продуктов, поскольку благодаря особенностям флуоресценции Eu3+ удается решить серьезную проблему неспецифического взаимодействия компонентов образца с иммунореактивными реагентами.
Работа [20] демонстрирует применение методов ELISA и TRFIA в применении к количественному анализу антибиотиков семейства тетрациклинов. Примечательно, что в качестве метки здесь использовался не хелатный комплекс Eu3+, а порфириновый комплекс Pt2+. Целью работы была разработка оптимального чувствительного метода определения содержания антибиотиков в образцах рыбы. Исследование специфичности использованных антител показало их высокую аффинность к нескольким циклинам: тетрациклину, окситетрациклину, хлоротетрациклину. Была доказана высокая эффективность TRFIA и его чувствительность, превосходящая чувствительность ELISA. Так, нижний предел детектирования окситетрациклина в образцах рыбы и линейный диапазон измерений для TRFIA составили 0,18 нмоль/кг и 0,45-855,02 нмоль/кг, для ELISA - 36 нмоль/кг и 6,75-1350 нмоль/кг соответственно.
Таким образом во всех исследованиях, упомянутых в данном обзоре чувствительность метода TRFIA оказалась выше чувствительности метода ELISA. Также, в среднем в работах, привлекающих TRFIA для анализа, был достигнут более широкий линейный диапазон измерений.
Выводы
Было разработано множество иммунологических методов анализа различных объектов. Получивший широкое распространение в практике иммуноферментный анализ (ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay), несмотря на ряд преимуществ, имеет и недостатки, основным из которых является вероятность получения ложного результата вследствие изменения фермент-промотированной окраски со временем.
При разработке альтернативы вышеупомянутых методов, очень желательны следующие требования к проводимому анализу:
Номер журнала Вестник науки №6 (63) том 1
Ссылка для цитирования:
Савченко И.В. ОБЗОР ВРЕМЯ-РАЗРЕШЕННОГО ФЛУОРОИММУНОХИМИЧЕСКОГО МЕТОДА АНАЛИЗА TRFIA // Вестник науки №6 (63) том 1. С. 1214 - 1239. 2023 г. ISSN 2712-8849 // Электронный ресурс: https://www.вестник-науки.рф/article/8738 (дата обращения: 19.05.2024 г.)
Вестник науки СМИ ЭЛ № ФС 77 - 84401 © 2023. 16+