Недорубов А.А., Харькова О.О., Щекин В.И., Демяшкин Г.А.
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ?-ТРИТИКАИНА В МОДЕЛИ ЦЕЛИАКИИ *
Аннотация:
данное исследование посвящено морфофункциональной оценки специфической активности рекомбинантной папаин-подобной протеиназы пшеницы тритикаина-? в модели целиакии in vivo на самцах мышей C57Bl/6, которых в течении 15 суток держали на глютеновой диете. При использовании тритикаин-альфа в дозах 4 мг/жив и 20 мг/жив выявлено снижение количества межэпителиальных лимфоцитов, по сравнению с группой без лечения. Отмечена тенденция к меньшему количеству лимфоцитов в группе 20 мг/жив, по сравнению с 4 мг/жив, однако их количество в среднем в 1,5 раза выше, чем в контроле.
Ключевые слова:
морфофункциональная оценка, моделирование целиакии, тритикаин-альфа
Введение. Целиакия является одной из наиболее часто встречающихся генетических заболеваний, которой страдает 0,5–1% населения земного шара. При этом, отмечается неуклонный рост непереносимости глютена. Потребление глютена, полученного из пшеницы, пациентами с глютеновой болезнью приводит к иммуноопосредованному повреждению тонкой кишки, которое характеризуется нарушением кишечной проницаемости, атрофией ворсин и воспалительной инфильтрацией собственной пластинки слизистой оболочки, богатой лимфоцитами и плазматическими клетками [1, 2]. Тритикаин-? обладает pH-зависимой специфичностью, определяемой аминокислотным остатком, расположенным в P1 положении субстрата. Кроме того, было показано, что тритикаин-? проявляет глютеназную и коллагеназную активности при 37°C в диапазоне рН 3,5-6,5 [3]. Коллагеназная активность тритикаина-? делает его потенциальным терапевтическим агентом в лечении ран и ожогов, а глютеназная активность фермента указывает на большой потенциал тритикаина-? для разработки фармацевтических препаратов, эффективных при лечении непереносимости глютена, в частности, целиакии. Примечательно, что сайты расщепления тритикаином-? были обнаружены в большинстве ранее идентифицированных токсичных пептидов, полученных из глютена, продуцирующих воспалительные реакции у пациентов с целиакией [3]. Цель исследования: морфофункциональная оценка специфической активности рекомбинантной папаин-подобной протеиназы пшеницы тритикаина-? в модели целиакии in vivo, включающую иммунологические факторы патогенеза.Материал и методы. Дизайн исследования. Для исследования специфической активности тритикаина-? in vivo была смоделирована целиакия на грызунах. Для этого активировали T-клеточный иммунный ответ на глютеновые пептиды.При разработке модели целиакии in vivo использовали алгоритм, представленный на рисунке 1. Рисунок 1. Схема адаптивного переноса. /Животных случайным образом распределяли по группам, используя в качестве критерия вес, так, чтобы индивидуальный показатель не отличался более чем на 10 % от среднего веса животных в каждой опытной группе и между группами. Животные – мыши C57Bl/6 (табл. 1).Таблица 1. Объем проводимого вмешательства при моделировании целиакии. /Введение тритикаина-?. В ходе исследования показано, что тритикаин-? полностью гидролизует пшеничный глютен в соотношении 20:1 в течение 5 минут. Содержание глютена в пшеничной муке до 10%. Животным вводили 20% суспензию муки в объеме 2 мл. Таким образом, доза глютена на одно животное составила 40 мг. Исследуемые дозы тритикаина-?: 4 мг/жив и 20 мг/жив. Препарат вводили ежедневно, два раза в сутки в течение 15 дней, с утра и вечером в одно и то же время.Морфологическое исследование. Образцы окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологическое исследование применяли для уточнения или исключения клинического диагноза, а также для оценки тяжести патологического процесса, его динамики. Морфологическая оценка целиакии основывалась на обнаружении признаков двух параллельно происходящих в слизистой оболочке тонкой кишки процессов: атрофии и воспаления. Атрофия слизистой оболочки носило при целиакии гиперрегенераторный характер и проявлялась, наряду с укорочением и утолщением ворсинок, удлинением (гиперплазией) кишечных крипт. При диагностике целиакии важное значение носило изменение отношения высоты ворсинки к глубине крипты, которое в норме составляет не менее 2:1. Воспалительная инфильтрация слизистой оболочки представлена межэпителиальной лимфоидной (МЭЛ) инфильтрацией (30 на 100 эпителиальных клеток в норме) и лимфоцитоплазмоцитарная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки. Клинические особенности целиакии включают атрофию ворсин и гиперплазию крипт, связанную с межэпителиальной лимфоидной инфильтрацией.Статистический анализ. Межгрупповые различия анализировали параметрическими или непараметрическими методами, в зависимости от типа распределения. Для оценки данных с признаками нормального распределения использован однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), с последующим межгрупповым сравнением (post hoc) с использованием теста Тьюки (post hoc Tukey's). Для межгруппового анализа массы тела использовали непараметрический тест Манна-Уитни. Для межгруппового анализа гистологических показателей использовали t-критерий Стьюдента.Результаты и их обсуждение В группе животных морфологического контроля в биоптатах тонкой кишки наблюдается нормальное строение однослойного цилиндрического эпителия с единичными бокаловидными клетками. Структура центральной колонны ворсинки соответствует норме, в ней дифференцируются отдельные кровеносные капилляры. Количество интраэпителиальных лимфоцитов не превышает нормальных значений (МЭЛ = 25.5, <30), лимфоидной инфильтрации ткани не наблюдается.Моделирование целиакии производили на мышах путем переноса макрофагально-лимфоцитарной культуры и антител сыворотки от животных-бридеров, иммунизированных глиадином, животным-реципиентам позитивного контроля. У мышей группы позитивного контроля выявлены патогистологические изменения, включающие умеренное увеличение числа и глубины кишечных крипт, повышение лимфоцитарной инфильтрации (МЭЛ=49,3, >30), выраженной атрофии ворсинок не выявлено, наблюдали частичную утрату поляризации однослойного цилиндрического эпителия (ядра смещены от базальной мембраны), просветление и вакуолизация околоядерной цитоплазмы, резкое уплощение и уплотнение щеточной каемки. Эти цитопатологические признаки свидетельствуют о нарушении нормальной функции эпителиальных клеток. Эпителиальный слой содержит визуально высокое количество лимфоцитов, а также отдельные плазматические клетки. В собственной пластинке слизистой оболочки тонкой кишки признаки хронического воспаления, структура центральной колонны ворсинки заметно нарушена (рис. 2). Все эти изменения позволяют охарактеризовать микропрепараты кишечных биопсий данной группы как 2 тип по Marsh-Оberhuber, что соответствует морфологическому диагнозу «целиакия»./Рисунок 2. Лимфоцитарно-плазмоцитарная инфильтрация слизистой оболочки тонкой кишки, утолщение и укорочение ворсинок на 15 сутки. 40 МЭЛ на 100 клеток. Окраска: гематоксилином и эозином, увелич. ?200. У мышей с экспериментальной целиакией, пролеченных тритикаином-альфа в низкой дозе, отмечается умеренное снижение интенсивности характерных для заболевания гистологических признаков. Количество и глубина кишечных крипт, а также количество ворсинок не изменяется по сравнению с позитивным контролем, однако уменьшается выраженность цитопатологических признаков. Эпителиоциты с правильными пропорциями, характерные для интактного цилиндрического эпителия, состояние щеточной каемки улучшается, и уменьшается выраженность просветления и вакуоляризации околоядерной области. Сдвиг апикально-базальной полярности сохраняется. Количество лимфоцитов в эпителиальном слое у животных, получающих тритикаин-альфа, визуально несколько меньше, чем у животных позитивного контроля, также обнаружили полнокровие центральных колонн кишечных ворсинок (свидетельство улучшения местного кровотока), данных за выраженное уменьшение интенсивности хронического воспаления не обнаружено. Количество лимфоцитов в собственной пластинке визуально не изменилось, МЭЛ=41,4,>30 (рис. 3). Изменения соответствуют типу 1 по классификации Marsh-Оberhuber. Патоморфологическая оценка микропрепаратов биопсий кишечника у мышей этой группы позволяет сделать вывод о незначительном позитивном эффекте применения тритикаина-альфа в дозе 4 мг/жив. Данная доза оказывает ограниченное позитивное влияние на течение процесса, но нельзя говорить о ее статистически значимой эффективности по гистоморфологическим данным./Рисунок 3. Тонкая кишка в группе животных с экспериментальной целиакией, пролеченных тритикаином-альфа в дозе 4 мг/жив. Окраска: гематоксилином и эозином, увелич. ?200.У мышей с экспериментальной целиакией, пролеченных тритикаином-альфа в высокой дозе, наблюдаемое улучшение состояния кишечного эпителия незначительно выше, чем в группе после введения дозы 4 мг/жив. Хотя количество и глубина кишечных крипт также не меняются по сравнению с животными позитивного контроля, отмечается более выраженное снижение выраженности клеточных аномалий, чем в группе в дозе 4 мг/жив. Эпителиоциты в микропрепаратах правильной формы с неизмененной щеточной каемкой и незначительно выраженных симптомах вакуолизации околоядерной области. Визуально эпителиальный слой содержит небольшое количество инфильтрирующих лимфоцитов, однако точный морфометрический подсчет дает более высокое среднее значение МЭЛ=39,5, >30, чем в группе животных, пролеченной тритикаином-альфа в дозе 4 мг/жив (рис. 4). Воспалительные изменения в собственной пластинке слизистой оболочки тощей кишки носили очаговые и менее распространенный характер, чем у животных в группах позитивного контроля и при лечении дозой 4 мг/жив. Обнаруженные изменения соответствуют типу 1 по классификации Marsh-Оberhuber, и недостаточны для постановки морфологического диагноза «целиакия».В данной группе можно утверждать, что доза 20 мг/жив способствует более выраженному снижению интенсивности патологического процесса в тонкой кишке по морфологическим данным, чем 4 мг/жив. Это позволяет судить об эффективности тритикаина-альфа в такой дозе в терапии данного заболевания./Рисунок 4. Тонкая кишка в группе животных с экспериментальной целиакией, пролеченных тритикаином-альфа в дозе 20 мг/жив. Окраска: гематоксилином и эозином, увелич. ?200.Сравнение числа МЭЛ между группами. Результаты подсчета числа МЭЛ приведены в графике 1. У мышей контрольной группы значение МЭЛ в основном не выходит за пределы порогового. У мышей позитивного контроля отмечается выраженное повышение числа МЭЛ, статистически значимое при сравнении с контрольной группой (p для различия медиан <<0,05). При применении тритикаина альфа в дозе 4 мг/жив количество МЭЛ ниже, различие с контрольной группой статистически значимо (p<0.05). Применение тритикаина альфа в дозе 20 мг также приводит к снижению количества МЭЛ, однако существенных различий с дозой 4 мг не наблюдается. Различие между группой 20 мг и контрольной группой статистически значимо (p<0.05). /График 1. Количество МЭЛ на 100 эпителиоцитов у животных. В ходе статистического анализа обнаружены достоверные различия между группой «Целиакия» и группой «4 мг/животное» (p=0,004, критерий Манна-Уитни), а также между группой «Целиакия» и группой «20 мг/животное» (p=0,001, критерий Манна-Уитни).Заключение. При морфофункциональной оценке специфической активности рекомбинантной папаин-подобной протеиназы пшеницы тритикаина-? в модели целиакии in vivo, включающую иммунологические факторы патогенеза, можно утверждать о более высокой эффективности применения анализируемого препарата в дозе 20 мг/жив по сравнению с препаратом в дозе 4 мг/жив. В ходе статистического анализа обнаружены достоверные различия между группой «Целиакия» и группой «4 мг/животное» (p=0,004, критерий Манна-Уитни), а также между группой «Целиакия» и группой «20 мг/животное» (p=0,001, критерий Манна-Уитни). Применение тритикаина-альфа в дозе 20 мг позволяет снизить МЭЛ на 20% по сравнению с позитивным контролем, до уровня, в два раза превышающего норму (по сравнению с 2,5-кратным превышением в позитивном контроле), а также уменьшить визуальную выраженность патоморфологических признаков целиакии в микропрепаратах тонкой кишки. Стадирование процесса при этом снижается с уровня March 2 до уровня Marsh 3 по классификации Marsh-Оberhuber.Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Номер журнала Вестник науки №12 (69) том 4
Ссылка для цитирования:
Недорубов А.А., Харькова О.О., Щекин В.И., Демяшкин Г.А. МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ?-ТРИТИКАИНА В МОДЕЛИ ЦЕЛИАКИИ // Вестник науки №12 (69) том 4. С. 1233 - 1245. 2023 г. ISSN 2712-8849 // Электронный ресурс: https://www.вестник-науки.рф/article/12010 (дата обращения: 19.05.2024 г.)
Вестник науки СМИ ЭЛ № ФС 77 - 84401 © 2023. 16+