Недорубов А.А., Харькова О.О., Щекин В.И., Демяшкин Г.А.
МОДЕЛИРОВАНИЕ ЦЕЛИАКИИ IN VIVO ИММУНИЗАЦИЕЙ ГЛИАДИНОМ С ПОСЛЕДУЮЩИМ АДАПТИВНЫМ ПЕРЕНОСОМ Т-ЛИМФОЦИТОВ МЫШАМ-РЕЦИПИЕНТАМ *
Аннотация:
данное исследование посвящено разработке модели целиакии in vivo на самцах мышей C57Bl/6 при пероральном способе введения в дозах 4 и 20 мг/жив. У мышей на 15 день, которых содержали на глютеновой диете, было подтверждено нарушение строения слизистой оболочки тонкой кишки соответствующее целиакии: выраженная лимфоцитарно-плазмоцитарная инфильтрация, утолщение и укорочение ворсинок, атрофия слизистой оболочки в сочетании очаговой гиперплазии кишечных крипт. Кроме того, у этих мышей были повреждены энтероциты и их плотные соединения. Диарея, вздутие живота, а также выпадение шерсти наблюдались у 20% мышей из группы, получавших глютеновое питание (Целиакия). В слизистой тонкой кишки обнаруживается
Ключевые слова:
целиакия, генетическое заболевание, факторы патогенеза
Введение. Целиакия является одной из наиболее часто встречающихся генетических заболеваний, которой страдает 0,5–1% населения земного шара. При этом, отмечается неуклонный рост непереносимости глютена. Потребление глютена, полученного из пшеницы, пациентами с глютеновой болезнью приводит к иммуноопосредованному повреждению тонкой кишки, которое характеризуется нарушением кишечной проницаемости, атрофией ворсин и воспалительной инфильтрацией собственной пластинки слизистой оболочки, богатой лимфоцитами и плазматическими клетками [1, 2]. Для понимания роли врождённого иммунного ответа, а также активации адаптивного иммунного ответа на глютен, которые являются патогномоничными критериями для развития целиакии были созданы in vivo модели данного заболевания. В настоящее время большинство из них используется для тестирования новых методов лечения, которые нацелены на различные пути, вызванные стимуляцией глютена.Однако в настоящий момент все разработанные in vivo модели целиакии недостаточно широко раскрывают механизмы патогенеза целиакии и поэтому не подходят для скрининга лекарственных препаратов для лечения данного заболевания. Все они играют ограниченную роль в разработке или доклиническом исследовании новых методов лечения и чаще используются для анализа специфических механизмов, связанных с патогенезом заболевания, что говорит об актуальности поиска новой in vivo модели. Папаин-подобные цистеиновые протеиназы (ППЦП, клан CA, семейство С1А широко распространены среди самых разнообразных организмов. Эти ферменты вовлечены практически во все сферы жизнедеятельности растений, такие как эмбриогенез, ответы на биотические и абиотические воздействия, старение, регулируемая клеточная смерть и другие. ППЦП являются относительно стабильными белками, присутствующими в достаточно агрессивных средах лизосом, а также апопласта и вакуолей растений [3, 4]. Активность и специфичность эндопептидаз семейства C1A достаточно подробно изучены in vitro с помощью различных тестов с использованием белковых или флуорогенных пептидных субстратов, а также пептидных ингибиторов. Кроме того, активное развитие современных биоинформатических методов позволило охарактеризовать молекулярные взаимодействия эндопептидаз с их субстратами in silico. Принято считать, что папаин-подобные протеиназы обладают относительно низкой специфичностью. В качестве единственного критерия узнавания пептидного субстрата предполагается наличие в его P2-положении гидрофобного аминокислотного остатка, включая остаток пролина, или остаток ароматической аминокислоты, а также, в некоторых случаях, остаток аргинина. Несмотря на это, в последнее время появляется все больше данных, указывающих на то, что ППЦП могут выполнять функцию высокоспецифичных ферментов, способных узнавать более протяженные участки в белковых субстратах и осуществлять их гидролиз в условиях, отличающихся от кислой среды, характерной для лизосом. Тритикаин-? обладает pH-зависимой специфичностью, определяемой аминокислотным остатком, расположенным в P1 положении субстрата. Кроме того, было показано, что тритикаин-? проявляет глютеназную и коллагеназную активности при 37°C в диапазоне рН 3,5-6,5 [5]. Коллагеназная активность тритикаина-? делает его потенциальным терапевтическим агентом в лечении ран и ожогов, а глютеназная активность фермента указывает на большой потенциал тритикаина-? для разработки фармацевтических препаратов, эффективных при лечении непереносимости глютена, в частности, целиакии. Примечательно, что сайты расщепления тритикаином-? были обнаружены в большинстве ранее идентифицированных токсичных пептидов, полученных из глютена, продуцирующих воспалительные реакции у пациентов с целиакией [5]. Таким образом, разработка и усовершенствование in vitro адекватной модели целиакии является необходимым этапом доклинических исследований нового лекарственного средства.Цель исследования: разработка модели целиакии in vivo, включающую иммунологические факторы патогенеза.Материал и методы. Дизайн исследования. Для моделирования целиакии на грызунах активировали T-клеточный иммунный ответ на глютеновые пептиды.Большинство современных моделей заболеваний животных с нарушенной регуляторной функцией Т-клеток основаны на дефиците CD4+/CD25+ Т-клеток (Treg). Дефицит Treg приводит к полиорганным воспалительным заболеваниям, при этом наиболее сильно поражаются поверхности слизистой оболочки, прежде всего кишечника. Это объясняется узнаванием микробных антигенов в слизистых оболочках эффекторными Т-клетками. Показано, что при переносе Т-клеток лимфопеническим мышам – способствует индукции антиген-специфического иммунитета и самопроизвольному развитию органоспецифического аутоиммунного заболевания. Поэтому мы предположили, что распознавание пищевого глютена переносимыми глиадином сенсибилизированными CD4+ T-клетками будет стимулировать дуоденит/энтерит у мышей-реципиентов. Для блокирования противовоспалительного фенотипа лимфоцитов и ремиссии активацию лимфоцитов проводили с использованием IFN-?, TNF?. IFN-? активирует макрофаги, которые, в свою очередь, секретируют TNF-? и матриксные металлопротеиназы (MMP), такие как MMP-12 и MMP-13, повреждающие энтероциты и плотные межклеточные контакты. В кишечных миофибробластах как TNF-?, так и IFN-? стимулируют экспрессию протеолитических MMP-1 и MMP-3. Такое высвобождение и активация MMP индуцирует протеолиз внеклеточного матрикса, что приводит к изменению структуры кишечника, наблюдаемой при целиакии. Суть исследования специфической активности тритикаина-? заключается в расщеплении экзогенных пептидов глютена и тем самым блокирование начального этапа иммунологического каскада целиакии.При разработке модели целиакии in vivo использовали алгоритм, представленный на рисунке 1. /Рисунок 1. Схема адаптивного переноса.Животных случайным образом распределяли по группам, используя в качестве критерия вес, так, чтобы индивидуальный показатель не отличался более чем на 10 % от среднего веса животных в каждой опытной группе и между группами. Животные – мыши C57Bl/6 (табл. 1).Таблица 1. Объем проводимого вмешательства при моделировании целиакии./ Моделирование целиакии на мышах C57Bl/6. Иммунизация животных. Для получения антител к глиадину мышей иммунизировали подкожно 20 мышей C57Bl/6 введением 200 мкг глиадина, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда (FCA) в течение пяти недель для последующего выделения антител. 1 неделя: подкожное введение 200 мкг глиадина, эмульгированного в FCA.2 неделя: подкожное введение 200 мкг глиадина, эмульгированного в IFA. Введение коклюшного токсина (КТ) (50 мкг/мл) в объёме 200 мкл.3 неделя: подкожное введение 200 мкг глиадина, эмульгированного в IFA.4 неделя: подкожное введение 200 мкг глиадина, эмульгированного в IFA.5 неделя: подкожное введение 200 мкг глиадина, эмульгированного в IFA.Выделение антител к глиадину. На шестой неделе проводи эвтаназию иммунизированных мышей путём цервикальной дислокации. Получали сыворотку путём естественного свёртывания крови и центрифугирования при 3500 об./мин. в течение 15 мин. Антиген-специфичная активация T-лимфоцитов. Для активации лимфоцитов двадцати мышам линии C57Bl/6 вводили подкожно 200 мкг глиадина, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда. Через два часа внутрибрюшинно вводили коклюшный токсин (КТ) в объёме 200 нг на животное для усиления активации иммунного ответа. Повторное введение КТ осуществлялось спустя 48 часов. Выделение активированных T-лимфоцитов. Через 10 дней после иммунизации мышей забивали путём цервикальной дислокации, селезёнку извлекали асептически и переносили в фалькон с физиологическим раствором. Селезёнки гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера в 15 мл RPMI-1640 с аланил-глутамином. Клеточную суспензию центрифугировали при 500g. 15 мин. К осаждённым клеткам добавляли по 25 мл буфера для лизиса эритроцитов и центрифугировали 15 мин. при 500g. Ресуспендировали осаждённые клетки в 20 мл среды RPMI-1640 и пропускали через фильтр 40 нм (BD Falcon). Подсчет количества живых клеток проводили в камере Горяева.Выделение культуры перитонеальных макрофагов. Брюшная полость мыши представляет собой «идеальное место» для сбора макрофагов. Количество макрофагов в брюшине оценивается примерно 1?106 макрофагов на мышь. Выделение перитонеальных макрофагов у двадцати мышей линии C57Bl/6 проводилось после эвтаназии путём цервикальной дислокации. Перитонеальный смыв осуществляли внутрибрюшинным введением раствора гепарина в физиологическом растворе по 2 мл. на животное. Пропускали через фильтр 40 нм (BD Falcon) для удаления неклеточных элементов. Полученный смыв макрофагов центрифугировали при 500g. 15 мин., при комнатной температуре. К осаждённым клеткам добавляли 25 мл буфера для лизиса эритроцитов и центрифугировали 15 мин. при 500g. Ресуспендировали осаждённые клетки в 20 мл среды RPMI-1640 и пропускали через фильтр 40 нм (BD Falcon). Подсчет количества живых клеток провели в камере Горяева.Культивирование кокультуры активированных T-лимфоцитов и перитонеальных макрофагов. Для получения воспалительных лимфоцитов, специфичных к белкам глиадина, получали кокультуру активированных T-лимфоцитов и перитонеальных макрофагов. Для этого выделенные активированных T-лимфоциты разводили полной средой RPMI-1640 до концентрации 2 ? 106 клеток на мл. Для создания кокультуры в конечный объём добавляли тотально перитонеальные макрофаги. Для стимуляции клеток использовали 2 мкг/мл глиадина, 2,5 мкг/мл ConA, 10 нг TNF? и 10 нг IFN-?.Адаптивный перенос реактивных T-лимфоцитов в мышей-реципиентов. Перенос клеток осуществлялся в самцов мышей С57Bl/6 путём внутрибрюшинной инъекции. Мышам вводили по 2 ? 107 клеток на мышь. Для активации провоспалительных факторов мышей содержали на глютеновом питании (пшеница).Морфологическое исследование фрагментов тонкой кишки (общее, морфометрическое, иммуногистохимическое). Образцы окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологическое исследование применяли для уточнения или исключения клинического диагноза, а также для оценки тяжести патологического процесса, его динамики.Результаты и их обсуждение. Клинические наблюдения за животными. На протяжении исследования все животные оставались живы. Во время эксперимента осуществляли ежедневное наблюдение за животными. В группах «Целиакия+безглютеновая диета» и «Здоровые» животные выглядели здоровыми, охотно поедали корм, реагировали на внешние раздражители, проявляли интерес к людям. Ни у одной мыши не было отмечено изменений поведения в сторону угнетения или возбуждения. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Визуально упитанность всех животных была удовлетворительной. Ни одно животное не проявляло признаков агрессии по отношению к другим мышам. Положение тела в пространстве было в пределах нормы. Нарушений координации движений и походки отмечено не было. Шерстный покров густой, ровный и блестящий, плотно прилегал к поверхности тела, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Кожа без признаков раздражения или воспаления. Тургор и целостность кожных покровов сохранены, пальпируемые образования отмечены не были. Область живота в объеме не увеличена. Дыхание ровное, обычного ритма, незатрудненное. Видимые слизистые оболочки бледно-розового цвета, блестящие, без нарушения целостности. У всех животных экзофтальма, отечности или гиперемии слизистых глаз не отмечалось. Слезотечения не наблюдалось. Нос розовый, умеренно влажный, патологические выделения отсутствовали. Уши бледно-розовые, обычной температуры, нагноений, воспаления, загрязнений ни у кого отмечено не было. Зубы у всех сохранены. Нарушений слюноотделения не наблюдалось. Частота мочеиспускания, цвет мочи, желудочно-кишечные показатели, мышечный тонус, рефлексы соответствовали физиологической норме. Зоосоциальное поведение не отличалось от здоровых животных.В группах «Целиакия+глютеновая диета» животные выглядели апатичными, слабо реагировали на внешние раздражители. У мышей наблюдали угнетение активности поведения. Животные были малоподвижны. Шерстный покров густой, взъерошенный, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Кожа без признаков раздражения или воспаления. Тургор и целостность кожных покровов сохранены, пальпируемые образования отмечены не были. Область живота в объеме сильно увеличена. Дыхание ровное, обычного ритма, незатрудненное. Видимые слизистые оболочки бледно-розового цвета, блестящие, без нарушения целостности. У всех животных экзофтальма, отечности или гиперемии слизистых глаз не отмечалось. Слезотечения не наблюдалось. Нос розовый, умеренно влажный, патологические выделения отсутствовали. Уши бледно-розовые, обычной температуры, нагноений, воспаления, загрязнений ни у кого отмечено не было. Зубы у всех сохранены. Нарушений слюноотделения не наблюдалось. Частота мочеиспускания, цвет мочи соответствовали физиологической норме, наблюдали диарею у всех животных в группе начиная с третьего дня. Набор массы животных замедлился, но статистических различий с группами «Целиакия+безглютеновая диета» и «Здоровые» нет.Морфологическое исследование. Наиболее выраженные патологические изменения обнаружили во втором и третьем сегментах двенадцатиперстной кишки: уплощение, частичная или полная редукция кишечных ворсинок, гиперплазия кишечных крипт, дегенерация энтероцитов, интраэпителиальный лимфоцитоз, и интенсивная лимфоцито-плазмоцитарную инфильтрацию собственной пластинки слизистой оболочки. В образцах со средней степенью выраженности целиакии признаки атрофии носили очаговых характер. Гиперплазия кишечных крипт включала в себя увеличение их количества, удлинение, расширение пролиферативной зоны, и выраженное увеличение числа митозов. Энтероциты при целиакии демонстрировали неспецифические изменения, включая «сглаженность» щеточной каемки, кубическую метаплазию, вакуолизацию, цитоплазматическую базофилию, потерю полярности и базальной ядерной ориентации. При морфологической оценки тонкой кишки по классификация Marsh-Оberhuber (Marsh, 1992, Oberhuber et al., 1999) можно выставить 2 балла: гипертрофия и углубление кишечных крипт при выраженной лимфоцитарной инфильтрации (МЭЛ>30), без атрофии кишечных ворсинок (рис. 2, 3)./Рисунок 2. Лимфоцитарно-плазмоцитарная инфильтрация слизистой оболочки тонкой кишки, утолщение и укорочение ворсинок на 15 сутки. 40 МЭЛ на 100 клеток. Окраска: гематоксилином и эозином, увелич. ? 200./Рисунок 3. Выраженное укорочение кишечных ворсин, а также их атрофия, клеточная воспалительная инфильтрация слизистой оболочки, количество МЭЛ 40 на 100 эпителиальных клеток, дистрофические изменения эпителиальных клеток ворсин. Окраска: гематоксилином и эозином, увелич. ? 200. Заключение. По данным гистологического исследования можно утверждать, что использованная в исследовании модель по состоянию на 15 сутки от начала эксперимента воспроизводит патоморфологическую картину при целиакии с умеренным течением, что подтверждается клинической картиной. Выявленные морфологические изменения не носят строго специфического характера из-за недостаточной длительности эксперимента, однако явно выражены при сравнении с нормальной гистологической картиной тонкой кишки у животных контрольной группы.Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Номер журнала Вестник науки №12 (69) том 4
Ссылка для цитирования:
Недорубов А.А., Харькова О.О., Щекин В.И., Демяшкин Г.А. МОДЕЛИРОВАНИЕ ЦЕЛИАКИИ IN VIVO ИММУНИЗАЦИЕЙ ГЛИАДИНОМ С ПОСЛЕДУЮЩИМ АДАПТИВНЫМ ПЕРЕНОСОМ Т-ЛИМФОЦИТОВ МЫШАМ-РЕЦИПИЕНТАМ // Вестник науки №12 (69) том 4. С. 1220 - 1232. 2023 г. ISSN 2712-8849 // Электронный ресурс: https://www.вестник-науки.рф/article/12009 (дата обращения: 19.05.2024 г.)
Вестник науки СМИ ЭЛ № ФС 77 - 84401 © 2023. 16+